抑制煙草青枯病型生物有機肥的田間防效研究

劉艷霞， 李 想， 曹 毅， 陸 寧， 石俊雄

(貴州省煙草科學(xué)研究院， 貴州貴陽 550000)

煙草青枯病是由青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一種以土壤傳播為主的毀滅性細菌性煙草病害。在我國已經(jīng)有14個省(區(qū))爆發(fā)流行，在長江流域及其以南煙區(qū)普遍發(fā)生。煙草青枯病的發(fā)生、流行和危害是諸多因素綜合作用的結(jié)果。以往對煙草青枯病的研究和防控主要集中在抗性品種選育、化學(xué)藥劑防控、土壤添加劑防治及改善栽培管理等方面，防控方法效果都不理想，煙草青枯病至今仍得不到有效的控制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

煙草種子采用當(dāng)?shù)仄贩NMS87，此品種煙葉品質(zhì)較好，但高感青枯病。

拮抗菌采用實驗室前期自安徽省健康煙草根際土壤分離篩選到的L-25(短短芽孢桿菌，Brevibacillusbrevis)和L-9(婁徹氏鏈霉菌，Streptomycesrochei)，其中，L-25經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(CGMCC No.3175)。

有機肥載體為菜粕酶解的氨基酸有機肥與牛糞以1 ∶1(質(zhì)量比)混合，含有機質(zhì)33.8%、氨基酸4.3%、N 4.20%、P2O52.26%、K2O 1.08%。肥料全部由江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術(shù)研究重點實驗室提供。

1.2 抑制煙草青枯病型生物有機肥的制備

將拮抗菌L-25接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，L-9接種于高氏一號液體培養(yǎng)基，三角瓶裝液量為1/5，30℃、170 r/m振蕩48 h。

表1 拮抗菌二次發(fā)酵前后微生物數(shù)量(cfu/g)

1.3 田間試驗設(shè)計

在安徽省宣城市黃渡鄉(xiāng)柏枧村分別于2009和2010年開展兩年煙草連作定位田間試驗。試驗前青枯病發(fā)病率非常嚴重，當(dāng)年已決定不再種植煙草。每年分別設(shè)置2個處理：1)對照處理(CK) 只施用975 kg/hm2的煙草專用復(fù)合肥料(N ∶P2O5∶K2O=10 ∶15 ∶25)； 2)生物有機肥處理(BOF) 在施用817.5 kg/hm2煙草專用復(fù)合肥料基礎(chǔ)上加施375 kg/hm2的BOF，磷和鉀不足的部分分別用過磷酸鈣和硫酸鉀補齊。供試土壤含有機質(zhì)24.2 g/kg、全氮1.32 g/kg、堿解氮143 mg/kg、速效磷10.17 mg/kg、速效鉀95.2 mg/kg，土壤pH 6.8。每處理4個重復(fù)區(qū)組，每區(qū)組120株煙株，加保護行等共占地0.07 hm2。田間管理及追肥的施用與當(dāng)?shù)仄渌麩熖锵嗤?/p>

1.4 田間試驗病害調(diào)查及相關(guān)性狀測量

分別于煙草移栽后50和105 d，觀測煙草發(fā)病情況并測定根際土壤微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性，煙葉采摘并烘烤后計算各處理產(chǎn)量。

1.4.1 發(fā)病率、病情指數(shù)與防控效果 分別于移栽后50和105 d，對煙田進行發(fā)病率和發(fā)病程度的調(diào)查測定，以株為單位分組調(diào)查病害嚴重程度：0級—全株無病；1級—莖部偶有褪綠斑，或病側(cè)1/2以下葉片凋萎；3級—莖部有黑色條斑，但不超過莖高1/2，或病側(cè)1/2至2/3葉片凋萎；5級—莖部黑色條斑超過莖高1/2，但未到達莖頂部，或病側(cè)2/3以上葉片凋萎；7級—莖部黑色條斑到達莖頂部，或病株葉片全部凋萎；9級—病株基本枯死[7]。發(fā)病率、病情指數(shù)與防控效果的計算如下：

發(fā)病率=(病株數(shù)/總株數(shù))×100%

每克樣品的菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×10×稀釋倍數(shù)

婁徹氏鏈霉菌選擇性培養(yǎng)基：在高氏一號培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入5 μg/mL的苯唑西啉(oxacillin)、30 μg/mL的頭孢噻肟(cefotaxime sodium salt)、50 μg/mL的氨曲南(aztreonam)、200 μg/mL的諾氟沙星(norfloxacin)和20 μg/mL的哌拉西林(piperacillin)，作為拮抗菌L-9選擇性培養(yǎng)基。

土壤或肥料總DNA采用Soil DNA Isolation Kit (Omega) 提取，以樣品DNA作為擴增模板，分別用病原菌(Ralstoniasolanacearum)與拮抗菌(Brevibacillusbrevis)的特異性引物在熒光定量PCR儀(StepOne Plus Real-time PCR System, ABI)上進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后確認擴增曲線和融解曲線，記錄每個樣品的Ct值，并將Ct值代入標準曲線方程，計算出樣品模板的初始基因拷貝數(shù)，最終換算出每克干土的茄科勞爾氏菌或短短芽孢桿菌的基因拷貝數(shù)。

茄科勞爾氏菌的正向引物flicF：GAACGCCAACGGTGCGAACT; 反向引物filcR：GGCGGCCTTCAGGGAGGTC[9]。短短芽孢桿菌L-25的正向引物Bre-F：AGACCGGGATAACATAG GGAAACTTAT; 反向引物Bre-R：GGCATGCTGA TCCGCG ATTACTA GC[10]。熒光定量PCR擴增反應(yīng)體系(20 μL)含SYBR? Premix Ex TaqTM (2×) (Takara) 10 μL、 ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL、 flicF 0.4 μL、 filcR 0.4 μL、 DNA模板 2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。溶解曲線步驟為95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，反應(yīng)結(jié)束后確認擴增曲線和融解曲線。

熒光定量PCR結(jié)果顯示，茄科勞爾氏菌的擴增效率達到91%，短短芽孢桿菌的擴增效率達到100%，標準曲線R2>0.99。茄科勞爾氏菌標準曲線方程為CtR=-3.564C0R+38.744，短短芽孢桿菌標準曲線方程為 CtB=-3.322C0B+37.209。

計算土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)分別由Shannon多樣性指數(shù)(H)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(D)和McIntosh均勻度指數(shù)(U)來表示[11]。

H=-∑PilnPi

其中Pi為第i孔相對吸光度值與整個平板相對吸光度值總和的比率；

其中，ni為第i孔的相對吸光值，N為相對吸光度值總和。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003處理，顯著性分析采用SPSS Base Ver.13.0統(tǒng)計軟件 (SPSS, IL, Chicago, USA)進行，用LSD、Duncan 新復(fù)極差進行多重比較(P≤0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青枯病的防控效果

大田中連續(xù)兩年施入生物有機肥后，青枯病的發(fā)生情況顯著減輕，BOF處理中發(fā)病株數(shù)和發(fā)病程度都明顯降低，青枯病初發(fā)期比對照延遲13天(表2)。第一年和第二年CK處理移栽50 d后的發(fā)病率和病情指數(shù)無顯著差異；而BOF處理的發(fā)病率和病情指數(shù)都存在顯著差異，第二年50 d的防控效果比第一年高14.0個百分點，105 d發(fā)病率降低了94.1%，防控效果高達95.4%。各處理50 d的發(fā)病率均顯著低于105 d，分別為105 d發(fā)病率的43.1%(1-CK)、25.9%(1-BOF)、45.4%(2-CK)和32.2%(2-BOF)。BOF處理50 d對煙草青枯病的防控效果高于105 d，分別為105 d的1.09(第一年)和1.01倍(第二年)。

表2 大田試驗田間小區(qū)防控效果

2.2 煙葉產(chǎn)量

兩年田間試驗結(jié)果都表明，施用生物有機肥可以顯著增加煙葉產(chǎn)量(圖1)。與CK處理相比，BOF處理第一年增產(chǎn)2.4倍，第二年增產(chǎn)2.6倍，CK處理兩年間產(chǎn)量無顯著差異，BOF處理第二年產(chǎn)量顯著高于第一年，比第一年增加11.9%。

2.3 煙草根際土壤微生物數(shù)量

移栽50 d后，BOF處理根際的細菌、放線菌和拮抗菌的數(shù)量都比CK處理明顯提高，而真菌和病原菌的數(shù)量卻顯著減少(P≤0.05)，病原菌數(shù)量由CK處理的107cfu/g，土下降到106cfu/g， 土(表3)。移栽105 d后，各種微生物數(shù)量也呈下降趨勢，細菌數(shù)量與50 d相比下降一個數(shù)量級，BOF處理的拮抗菌數(shù)量分別減少23.2(第一年)和14.8倍(第二年)；病原菌茄科勞爾氏菌的數(shù)量在兩處理間沒有顯著差異，都在1.0×106cfu/g土數(shù)量級上；放線菌數(shù)量在數(shù)量級上也無差異。

2.4 煙草根際土壤微生物群落功能多樣性

土壤中施入生物有機肥的處理Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Mclntosh指數(shù)均高于病土CK處理(表4)，表明生物有機肥可以有效改善土壤微生物的多樣性，而長期施用化肥會降低土壤微生物的豐富度和均勻度。兩年的試驗結(jié)果表明，第一年BOF處理Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Mclntosh指數(shù)顯著高于CK處理，50 d增幅分別為28.4%、 76.9%和10.6%；第二年BOF處理土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)與CK處理相比差異明顯，50 d增幅分別為36.2%、 86.3%和19.1%，煙株移栽105 d后的根際土壤微生物群落功能多樣性比50 d有所下降，但BOF處理仍顯著高于CK處理。BOF處理第二年根際土壤微生物群落50 d Shannon指數(shù)和Mclntosh指數(shù)顯著高于第一年，Simpson指數(shù)無差異，105 d Shannon指數(shù)、Simpson 指數(shù)和Mclntosh指數(shù)均顯著高于第一年。

圖1 施用生物有機肥對煙葉產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of the application of BOF on tobacco yield

2.5 煙草根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性

從圖2可以看出，與CK處理相比，BOF處理細菌的條帶增加了，真菌條帶減少了，即細菌種類增加的同時真菌的種類有所減少。通過DGGE圖譜的相似性聚類分析發(fā)現(xiàn)，兩年BOF處理的細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)具有相似性，CK處理的細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)也具有相似性。

表3 煙草根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量(cfu/g, soil)

3 討論與結(jié)論

有機肥與功能微生物(生防菌、促生菌等)相結(jié)合制成微生物有機肥后施用，對各種土傳病害的防控體現(xiàn)出很好的效果[12-13]，目前國內(nèi)報道的生物有機肥對香蕉枯萎病[14-15]、黃瓜枯萎病[16]、甜瓜枯萎病[17]、西瓜枯萎病[18]、棉花黃萎病[19]等具有較好的防控效果。本試驗中，生物有機肥處理青枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)較對照相比顯著下降，防控效果分別達到75.2%(第一年)和95.4%(第二年)。此外，生物有機肥還能延緩青枯病的發(fā)病時間，初發(fā)期推遲13 d，移栽后50 d的防控效果分別比105 d高9.3%(第一年)和1.2%(第二年)。這主要由于采用的拮抗微生物均從煙草根際土篩選獲得，在煙草根際上具有很強的定殖能力；同時拮抗菌以有機肥為載體，經(jīng)過二次固體發(fā)酵后施入土壤中，在土壤中的定殖能力更強，對病原菌起到較好的抑制作用[20]，進而推遲煙草植株發(fā)病時間和顯著降低青枯病發(fā)病指數(shù)。

圖2 移栽105天煙草根際土壤的細菌(左)和真菌(右)DGGE電泳圖及聚類分析Fig.2 DGGE pattern and the phylogenetic tree of the bacterial community (left) and fugal community (right) of rhizosphere soil in different treatments in the pot experiment

生物有機肥對土壤中青枯病病原菌有較好的抑制作用，主要是因為其有效改善土壤微生物平衡，恢復(fù)被破壞的土壤生態(tài)系統(tǒng)，從而建立起復(fù)雜而健康的土壤微生物體系[23]。拮抗菌在有機肥協(xié)助下形成“基質(zhì)-菌群”生態(tài)系統(tǒng)，更有利于調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境，可改變根際土壤微生物生態(tài)特征和物理化學(xué)特征，從而起到防病、抑病的作用[24]。本試驗中生物有機肥處理根際土壤中的細菌和放線菌的數(shù)量較對照處理均顯著增加，真菌的數(shù)量下降明顯，土壤微生物由真菌主導(dǎo)型向細菌主導(dǎo)型轉(zhuǎn)化, 土壤趨向健康方向發(fā)展[25]。生物有機肥在根際不但可以影響土壤的微生物數(shù)量，還可以調(diào)節(jié)微生物的群落多樣性和功能多樣性。本試驗中通過DGGE方法分析發(fā)現(xiàn)，與對照相比，生物有機肥處理中細菌的條帶顯著增多，真菌條帶明顯減少，從而說明，生物有機肥可以調(diào)節(jié)土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)多樣性，這一結(jié)果與張慧[26]和Lang等[27]通過DGGE分析生物有機肥對棉花根際土壤真菌區(qū)系的影響類似。當(dāng)土壤肥力水平提高、微生態(tài)環(huán)境得到改善、微生物活性增強時，土壤微生物群落功能多樣性會提高[28-29]。本試驗中，生物有機肥處理土壤的Shannon多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)和McIntosh均勻度指數(shù)都顯著高于對照，說明生物有機肥不但提高了土壤微生物整體代謝能力和數(shù)量[30]，即增加土壤微生物功能多樣性，而且微生物群落間無絕對優(yōu)勢種群，對土壤中各種碳源的利用更加均衡，從而達到改善土壤微生物區(qū)系的目的，使土壤健康、可持續(xù)發(fā)展。

綜上所述，施用抑制煙草青枯病型生物有機肥可以有效降低青枯病發(fā)病率，增加煙葉產(chǎn)量，降低土壤中病原菌濃度進而減少病原菌對根系的侵染，有利于連作土壤的生態(tài)系統(tǒng)向健康可持續(xù)發(fā)展的方向轉(zhuǎn)化，達到對煙草青枯病良好的防控效果。

參考文獻:

[1] 王雅平, 劉伊強, 潘乃穟. 枯草芽孢桿菌TG26防病增產(chǎn)的研究[J]. 中國生物防治, 1993, 9(2):63-68.

Wang Y P, Liu Y Q, Pan N S. Study on the biological control of plant diseases with Bacillus subtilis strain TG26 [J]. Chinese Journal of Biological Control, 1993, 9(2):63-68.

[2] Abawi G S, Widmer T L. Impact of soil health management practices on soilborne pathogens, nematodes and root diseases of vegetable crops [J]. Applied Soil Ecology, 2000, 15:37-47.

[3] 李勝華, 谷麗萍, 劉可星, 等. 有機肥配施對番茄土傳病害的防治及土壤微生物多樣性的調(diào)控[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2009, 15(4):965-969.

Li S H, Gu L P, Liu K Xetal. Effect of combined application of organic fertilizers on the control of soilborne diseases and the regulation of soil microbial diversity [J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2009, 15(4):965-969.

[4] Anuratha C S, Gnanamanickam S S. Biological control of bacterial wilt caused bypseudomonassolanacearumin India with antagonistic bacteria [J]. Plant and Soil, 1990, 124:109-116.

[5] 劉瓊光, 李忠, 唐孜. 拮抗細菌和土壤添加劑防治煙草青枯病[J]. 中國生物防治, 1999, 15(2):94-95.

Liu Q G, Li Z, Tang Z. Biological control of tobacco bacterial wilt by soil amendments and antagonistic bacteria [J]. Chinese Journal of Biological Control, 1999, 15(2):94-95.

[6] 趙斌, 何紹江. 稀釋平板測數(shù)法[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2002. 69-72.

Zhao B, He S J. Dilution plate counting method [M]. Beijing:Science Press, 2002. 69-72.

[7] GB/T 23222-2008. 煙草病蟲害分級及調(diào)查方法[S].

GB/T 23222-2008. Grade and investigation method of tobacco diseases and pests[S].

[8] Hervas A, Landa B, Datnoff L Eetal. Effects of commercial and indigenous microorganisms on fusarium wilt development in Chickpea [J]. Biological Control, 1998, 13:166-176.

[9] Schonfeld J, Heuer H, Van Elsas J Detal. Specific and sensitive detection of ralstonia solanacearum in soil on the basis of pcr amplification of flic fragments [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(12):7248-7256.

[10] Shida O, Takagi H, Kadowaki Ketal. Proposal for two new genera,brevibacillusgen.Nov. andaneurinibacillusgen.Nov [J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1996, 46(4):939-946.

[11] Staddon W J, Duchesne L C, Trevors J T. Microbial diversity and community structure of postdisturbance forest soils as determined by sole-carbon-source utilization patterns [J]. Microbial Ecology, 1997, 34:125-130.

[12] Hoitink H A J, Boehm M J. Biocontrol within the context of soil microbial communities:A substrate-dependent phenomenon [J]. Annual Review of Phytopathology, 1999, 37:427-446.

[13] Trillas M I, Casanova E, Cotxarrera L. Composts from agricultural waste and thetrichodermaasperellumstrain t-34 suppressrhizoctoniasolaniin cucumber seedlings [J]. Biological Control, 2006, 39:32-38.

[14] Zhang N, Wu K, He Xetal. A new bioorganic fertilizer can effectively control banana wilt by strong colonization withbacillussubtilisn11 [J]. Plant and Soil, 2011, 344:87-97.

[15] 何欣, 郝文雅., 楊興明, 等. 生物有機肥對香蕉植株生長和香蕉枯萎病防治的研究[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2010, 16:978-985.

He X, Hao W Y, Yang X Metal. Effects of bioorganic fertilizer on growth and controlling fusarium-wilt disease of banana [J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2010, 16:978-985.

[16] Zhang S, Raza W, Yang Xetal. Control of fusarium wilt disease of cucumber plants with the application of a bioorganic fertilizer [J]. Biology and Fertility of Soils, 2008, 44:1073-1080.

[17] Zhao Q, Dong C, Yang Xetal. Biocontrol offusariumwilt disease forcucumismelomelon using bio-organic fertilizer [J]. Applied Soil Ecology, 2011, 47:67-75.

[18] 凌寧, 王秋君, 楊興明, 等. 根際施用微生物有機肥防治連作西瓜枯萎病研究[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2009, 15(5):1136-1141.

Ling N, Wang Q J, Yang X Metal. Control ofFusariumwilt of watermelon by nursery application of bio-organic fertilizer [J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2009, 15(5):1136-1141.

[19] 張慧, 楊興明, 冉煒, 等. 土傳棉花黃萎病拮抗菌的篩選及其生物效應(yīng)[J]. 土壤學(xué)報, 2008, 45(6):1095-1101.

Zhang H, Yang X M, Ran Wetal. Screening of bacteria antagonistic against soil-borne cotton verticilllium wilt and their biological effects on the soil-cotton system [J]. Acta Pedologica Sinica, 2008, 45(6):1095-1101.

[20] El-Abyad M S, El-Sayed M A, El-Shanshoury A Retal. Towards the biological control of fungal and bacterial diseases of tomato using antagonisticstreptomycesspp[J]. Plant and Soil, 1993, 149:185-195.

[21] 葛慈斌, 劉波, 泉育菁. 青枯雷爾氏菌致病力的番茄組培苗鑒定方法研究[J]. 武夷科學(xué), 2004, 20(20):13-16.

Ge C B, Liu B, Quan Y Q. Study on the methods on identifying the virulence ofRalstoniasolanacearumusing tissue cultured tomatoes [J]. Wuyi Science, 2004, 20(20):13-16.

[22] 殷博. 幾種作物根系分泌物對土壤微生物的影響[D]. 哈爾濱:黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2009.

Yin B. The effect of several root exudates on soil microorganisms[D]. Harbin:Master thesis, Heilongjiang University, 2009.

[23] Liu Y, Shi J, Feng Yetal. Tobacco bacterial wilt can be biologically controlled by the applicaiton of antagonistic strains in combination with organic fertilizer [J]. Biology and Fertility of Soils, 2013, 49(4):447-464.

[24] 張志紅, 李華興, 韋翔恩, 等. 生物肥料對香蕉枯萎病及土壤微生物的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境, 2008, 17 (6):2421-2425.

Zhang Z H, Li H X, Wei X Eetal. Influence of biological fertilizers on banana wilt disease and microorganisms in soil [J]. Ecological Environment, 2008, 17 (6):2421-2425.

[25] Bottomley P J, Yarwood R R, Kageyama S Aetal. Responses of soil bcterial and fungal communities to reciprocal transfers of soil between adjacent coniferous forest and meadow vegetation in the cascade mountains of Oregon [J]. Plant and Soil, 2006, 289:35-45.

[26] 張慧. 防治棉花黃萎病微生物有機肥的研制及其生物效應(yīng)[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2008.

Zhang H. Development of a bio-organic fertilizer against cottonverticilliumwilt and its effect on the soil-cotton system [D]. Nanjing:MS thesis, Nanjing Agricultural University, 2008.

[27] Lang J, Hu J, Ran Wetal. Control of cottonverticilliumwilt and fungal diversity of rhizosphere soils by bio-organic fertilizer [J]. Biology and Fertility of Soils, 2012, 48:191-203.

[28] 張志明, 許艷麗, 韓曉增, 等. 連續(xù)施肥對農(nóng)田黑土微生物功能多樣性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2012, 31(3):647-651.

Zhang Z M, Xu Y L, Han X Zetal. Effect of continuous fertilization on microbial functional diversity in black soil under cropland [J]. Chinese Journal of Ecology, 2012, 31(3):647-651.

[29] 樊曉剛, 金軻, 李兆君, 等. 不同施肥和耕作制度下土壤微生物多樣性研究進展[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2010, 16 (3):744-751.

Fan X G, Jin K, Li Z Jetal. Soil microbial diversity under different fertilization and tillage practices:A review [J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2010, 16 (3):744-751.

[30] 孫薇, 錢勛, 付青霞, 等. 生物有機肥對秦巴山區(qū)核桃園土壤微生物群落和酶活性的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2013, 19 (5):1224-1233.

Sun W, Qian X, Fu Q Xetal. Effects of bio-organic fertilizer on soil microbial community and enzymes activities in walnut orchards of the Qinling-Bashan Region[J]. Journla of Plant Nutrition and Fertilizer, 2013, 19 (5):1224-1233.