長期施肥對植煙土壤微生物的影響

楊宇虹， 晉 艷， 黃建國， 段玉琪， 徐照麗， 袁 玲*

(1 云南省煙草農業科學研究院， 云南玉溪 650032； 2 西南大學資源環境學院，四川重慶 400716)

在烤煙栽培過程中，施肥顯著影響煙葉產量、產值和香氣[1]，單施化肥和化肥有機肥配合施用是目前采用的主要施肥方式。長期定位試驗表明，單施化肥短期內不造成煙葉減產和質量降低，但不利于培肥土壤和烤煙的可持續生產[2]。

化肥配施有機肥能提供土壤微生物需要的碳源和氮源，顯著提高微生物量碳和氮[3-4]。長期大量施用化肥可增加含iC15 ∶0磷脂脂肪酸的細菌種群；長期施用有機肥和秸稈還田則相反，但可增加含aC15 ∶0的細菌種群[5]。利用Biolog進行的研究表明，在氮、磷、鉀長期平衡施肥的稻田土壤中，微生物活性強、代謝快[6]。通過PCR-DGGE分析結果顯示，在長期氮、磷、鉀無機肥配施有機肥處理的土壤中，微生物多樣性指數最大、細菌種類最多，顯著高于不施肥的處理[3]。因此，施肥顯著影響土壤微生物的數量、種群和多樣性。土壤微生物是土壤的主要組成部分，驅動土壤新陳代謝和生物化學反應，與土壤養分的轉化供應密切相關。在多數情況下，土壤微生物活性與土壤有效氮的含量呈正相關；在有機質含量較高的土壤中，微生物活性與土壤磷的生物有效性密切相關[7-8]。因而土壤微生物活性可視為土壤健康和肥力的重要指標之一[9]。施肥通過影響土壤微生物活動，進而影響土壤養分的轉化、供應和作物生長發育。

自上世紀九十年代以來，我國在主要農業生產區域建立了長期肥力肥效監測基地，大量報道了施肥對水稻土、潮土、黑土、黃土、黑鈣土和紅壤等土壤微生物的長期作用[3-6,10]。云南是我國烤煙主產區，當地紅壤的成土母質和理化及生物學性質顯著不同于我國其它地區的紅壤。由于施肥對植煙土壤微生物影響方面的研究還少有報道，為此，本試驗利用云南省煙草農業科學研究院云南玉溪研和試驗基地的長期肥料試驗，研究了長期單施無機肥與長期無機肥和有機肥配施對土壤微生物的影響，旨在為烤煙科學施肥和土壤培肥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

1.2 試驗處理

1.3 土樣采集與分析

在煙株旺長期，采集0—20 cm的耕作層，去除植物殘體、礫石等，置于4℃冰箱保存備用。采用氯仿熏蒸(0.5 mol/L K2SO4提取土壤， K2Cr2O7氧化法測定微生物量碳，凱氏定氮法測定微生物量氮[11]。微生物磷脂脂肪酸(phosphor lipid fatty acids，簡稱PLFAs，下同)的提取、分析和命名參照Frostegard和Kourtev的方法[12-13]。用 “X ∶YωZ”表示PLFAs分子式，其中X代表脂肪酸分子的C原子總數，Y代表不飽和烯鍵的數目，ω代表烯鍵距離羧基的位置，Z為烯鍵的位置。

土壤中的細菌(牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基)、真菌(馬丁氏瓊脂培養基)、放線菌(高氏一號瓊脂培養基)以及自生固氮菌(Ashby無氮瓊脂培養基)、磷細菌(磷酸鈣+植酸培養基)、鉀細菌(鋁土礦瓊脂培養基)等[14]用常規分離計數法。

通過形態和生理生化反應等將自生固氮菌、磷細菌和鉀細菌鑒定至屬[13]，包括革蘭氏和芽孢染色，好氧性測定；并對氧化酶、過氧化氫酶、MR和VP反應；葡萄糖氧化，甘乳醇和乳糖發酵；脲素、淀粉和明膠分解；H2S和吲哚產生，檸檬酸鹽利用等指標進行測定。

1.4 土壤微生物種群特征參數的計算

1.5 數據分析

試驗數據用Excel進行計算，SPSS 16.0軟件進行統計分析及顯著性水平檢驗。

2 結果與分析

2.1 土壤可培養微生物數量

在植煙土壤中，可培養細菌最多，真菌次之，放線菌最少；施肥顯著提高了可培養細菌、真菌和放線菌數量(細菌例外，CF與CK處理相似)。在CFM處理的土壤中，可培養微生物數量顯著高于CF處理。可培養細菌、真菌、放線菌數量CFM分別比CK增加了6.14倍、 2.30倍、 1.56倍(表1)。

表1 植煙土壤可培養細菌、真菌和放線菌的數量

2.2 土壤微生物量碳和微生物量氮

從表2可以看出，施肥顯著提高土壤微生物量碳、氮，尤以CFM處理最為顯著。在CF 和CFM處理的土壤中，微生物量碳分別比CK增加了71.8%和2.46倍。值得注意的是，在不同施肥的土壤中，微生物量碳/氮比顯著不同，分別為14.8(CK)、13.3(CF)和11.2(CFM)。

2.3 土壤微生物標記性PLFAs組成及含量

表3可見，在CK、CF和CFM處理的土壤中，分別檢測到17、19和22種土壤微生物的標記性PLFAs，包括細菌(12 ∶00、i14 ∶0、i15 ∶0、a15 ∶0、15 ∶00、14 ∶02OH、14 ∶03OH、i16 ∶0 c、16 ∶1 c、16 ∶00、a16 ∶0 2OH 、i17 ∶0、17 ∶1ω6,c、a17 ∶0、17 ∶0 c、18 ∶1ω7 c、17 ∶00、20 ∶00)、放線菌(10Me 17 ∶0、10Me18 ∶0)和真菌(18 ∶1ω9 c、18 ∶8ω9, 12)土壤微生物的標記性PLFAs。

表2 施肥對土壤微生物量碳和氮的影響(μg/g, dry soil)

從土壤微生物標記性PLFAs總量看，CFM處理的土壤最高，CF次之，CK最低。其中，與CK相比，代表細菌的PLFAs,分別增加了40.49%(CF)和105.91%(CFM)；代表真菌的PLFAs分別增加了15.59%(CF)和39.24%(CFM)；代表放線菌的PLFAs分別增加了-28.56%(CF)和33.65%(CFM)。此外，各PFLAs的增減變化因其種類和施肥處理不同而異。

2.4 植煙土壤細菌、真菌、放線菌的種群特征

利用PLFAs計算獲得的植煙土壤細菌、真菌和放線菌種群特征值如表4所示。施肥顯著提高了土壤微生物多樣性指數，但CF和CFM處理之間無顯著差異。土壤微生物的均勻度指數CK處理最高，達到1.7385，CF和CFM顯著低于CK處理，但CF和CFM處理的均勻度指數相似。CF處理與CK相比土壤微生物優勢度指數明顯提高，但CFM對優勢度指數無顯著影響。

2.5 土壤有益微生物

2.5.1 有益微生物數量 從表5可以看出，CFM處理對自生固氮菌數量無顯著影響，但顯著提高了土壤無機磷細菌和鉀細菌的數量，分別比不施肥(CK)處理增加了1.15倍和1.02倍。在CF處理的土壤中，自生固氮菌和無機磷細菌數量分別比不施肥降低了56.69%和41.30%，但鉀細菌與CK無顯著差異。

2.5.2 屬群的鑒定 用無菌水提取供試土壤(水 ∶土=10 ∶1)，再稀釋100倍。在各處理的土壤中，自生固氮菌、無機磷細菌和鉀細菌的菌落總數CFM最高，CK次之， CF最低，分別為226、189和144個(表6)。

表3 不同施肥處理土壤PLFAs的組成及含量(μg/g)

表4 基于PLFAs的土壤微生物種群特征值

表5 植煙土壤自生固氮菌、無機磷細菌和鉀細菌數量(cfu ×103/g, dry soil)

3 討論與結論

烤煙是需肥量較大的作物，在種植過程中其化肥用量遠遠高于小麥、玉米、紅薯等糧食作物。長期大量施用化肥會產生一系列的生態環境問題，如土壤板結、肥料利用率降低、水體富營養化等[16]。在植煙土壤中，可培養微生物數量(常規分離計數)、微生物量碳和氮以及PLFAs總量等不施肥(CK)處理最低，單施化肥(CF)次之，化肥與有機肥配施(CFM)最高，表明施肥尤其是化肥與有機肥配施能顯著提高土壤微生物數量，有益于土壤養分的轉化供應，提高生物有效性。在種植玉米和水稻的土壤中，施用有機肥提高了土壤微生物量碳和氮，并隨著有機肥用量的增加而提高[17-18]。在棉田土壤中，施用化肥和有機肥顯著增加細菌、真菌和放線菌等微生物的數量[19]。在施用化肥、秸稈還田及化肥配施有機肥的稻田土壤中，土壤微生物量碳和PLFAs總量顯著高于不施肥的土壤[5]。施肥顯著增加土壤微生物的原因可能是提高了作物生物量，歸還土壤的枯枝落葉和根茬也相應增加。化肥與有機肥配施(CFM)處理不僅直接增加土壤有機質，同時又提供豐富的氮素，增加微生物需要的營養和能源物質，更加適合土壤微生物的生長繁殖[20]。位于我國西南地區的云南煙區，人多地少，烤煙連作現象比較普遍，為了防治病原微生物傳播，煙葉收后植株殘體全部取走。因此，單施化肥(CF)歸還土壤的有機物極少，這可能是土壤微生物顯著低于CFM處理的原因之一。

表6 烤煙根際自生固氮菌、磷細菌和鉀細菌的屬群鑒定

在不同施肥的土壤中，微生物量C/N顯著不同，喻示著土壤微生物種群結構差異顯著。本試驗中，在CK、CF和CFM處理的土壤中，分別檢測出17、19和22種微生物標記性PFLAs，各PFLAs的增減變化也因其種類和施肥處理不同而異，與前人的研究結論類似[ 3,5-6]。施肥顯著提高土壤微生物群落的多樣性指數。在通常情況下，生態環境良好，生物群落穩定，物種豐富，故生物群落的多樣性指數是評價生態環境的優劣的重要指標之一[21-22]。有理由認為，在烤煙種植過程中，施肥尤其是化肥與有機肥配施可以改善土壤生態環境。此外， CF處理提高土壤微生物優勢度指數，表明化肥對土壤微生物具有選擇富集作用，適者迅速生長繁殖，否則受到抑制。因此，長期單施化肥存在減少土壤微生物種群的風險。

從有益微生物(自生固氮菌、無機磷細菌和鉀細菌)的數量看，盡管化肥與有機肥配施(CFM)對自生固氮菌數量影響不大，但顯著提高了土壤無機磷細菌和鉀細菌的數量；相反，單施化肥降低自生固氮菌和無機磷細菌數量。說明化肥與有機肥配施總體上促進土壤有益微生物的繁殖生長，CF處理則產生抑制作用。眾所周知，在養分投入量相等，化學氮肥在土壤中迅速釋放，高濃度的NH3抑制固氮菌和無機磷細菌的繁殖生長[19]。需要指出的是，大多數自生固氮菌、無機磷細菌和鉀細菌都屬于根際促生細菌，能分泌生長活性物質，如生長素、細胞分裂素、玉米素等，進而促進植物生長[23-25]。化肥與有機肥配施不僅直接提供植物營養，而且還促進植物生長，增加生物固氮，活化土壤無機磷，提高肥料利用率。此外，在化肥與有機肥配施的土壤中，自生固氮菌、無機磷細菌和鉀細菌共有20個屬，不施肥土壤為19個屬，單施化肥土壤僅16個屬， 說明單施化肥不僅降低了土壤有益微生物菌落數，而且減少了它們的屬數量，長期單施化肥不益于土壤健康。

總之，在化肥與有機肥配施的土壤中，微生物尤其是有益微生物的數量和種群結構總體上優于單施化肥。因此在煙葉生產中，應提倡化肥與有機肥配施。

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