超聲波破碎輔酶Q10工藝研究

朱勇峰等

摘 要：通過單因素試驗和正交試驗對超聲波提取輔酶Q10的工藝條件進行了優(yōu)化，確定了類球紅細菌輔酶Q10的最佳提取條件為：輸出功率為55%、每次輻射時間為3s、工作總時間為6min、菌液濃度OD為23.4，條件優(yōu)化后輔酶Q10單位細胞產(chǎn)量達到11.86mg/L。

關(guān)鍵詞：類球紅細菌；輔酶Q10；單位細胞產(chǎn)量

中圖分類號 Q939.97 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）06-23-03

輔酶Q10，又稱癸烯醌、泛醌（商品名：Coenzyme Q10，簡稱CoQ10），是一種存在于革蘭氏陰性細菌、植物細胞和動物肝臟中的脂溶性醌類化合物，是細胞呼吸傳遞鏈上的重要遞氫體[1]。輔酶Q10作為一種生理活性物質(zhì)，具有保健、改善作用，因此被廣泛應用于藥業(yè)、化妝和食品產(chǎn)業(yè)[2]。輔酶Q10參與細胞的代謝活動，并且可以用來治療心臟病、高膽固醇、高血壓、老年癡呆癥、帕金森癥等疾病[3]。

目前制備生產(chǎn)輔酶Q10的方法有微生物發(fā)酵法、化學合成法和動植物組織提取法[4]，其中微生物發(fā)酵法被認為是最有發(fā)展前景的[5-7]，輔酶Q10存在菌體細胞線粒體內(nèi)膜上，屬于細胞內(nèi)產(chǎn)物。所以輔酶Q10的提取和檢測首先涉及到如何充分地破壞細胞使其細胞內(nèi)的輔酶Q10盡量的釋放出來而被檢測。而輔酶Q10的側(cè)鏈存在著不飽和雙鍵，使輔酶Q10的在提取過程中容易受到氧化劑、紫外線等因素的影響，這是由于輔酶Q10的側(cè)鏈存在著不飽和雙鍵易受到這些因素影響而發(fā)生氧化和加成反應，使其散失原有的生物活性，甚至會形成對人體有害的物質(zhì)，因此研究提取因素對輔酶Q10的影響具有重要的應用價值。

為了能夠得到和檢測輔酶Q10，首先必須對菌體進行破壁，使其體內(nèi)輔酶Q10能夠釋放出來，而常見的細胞破壁方法有非機械法和機械法，本研究選擇了機械法中的超聲波破壁法，對超聲波輸出功率、每次輻射時間、工作總時間和菌液濃度條件進行了優(yōu)化，以確定輔酶Q10的最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株 Rhodobacter sphaeroate EIM，由福建師范大學工業(yè)微生物教育部工程研究中心保藏。

1.2 主要試劑和儀器 無水乙醇、電熱恒溫水浴鍋（DK-80）、超聲波破碎儀（BIOMETRA）、高速冷凍離心機（AllegraTMX-22R Centrifuge）、超高效液相色譜儀（Acquity UPLC）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵液的預處理 輔酶Q10是類維生素脂溶性物質(zhì)，且屬于胞內(nèi)產(chǎn)物，因此提取輔酶Q10包括以下2步：進行細胞的破碎和輔酶Q10的溶解分離。取5mL發(fā)酵液在8 000r/min的條件下離心10min，棄去上清液，無水乙醇洗滌1～2次，并用無水乙醇制成懸濁液，定容至20mL，利用超聲波破碎儀進行破碎細胞。

1.3.2 菌體干重的測定 發(fā)酵液經(jīng)過8 000r/min離心10min，去上清液并用蒸餾水洗滌后，放置100℃烘箱中烘干至恒重后稱量。

1.3.3 發(fā)酵液中輔酶Q10的測定 取1mL發(fā)酵液置于10mL的棕色容量瓶中，滴加20μL的6mol/L的HCl，加入1mL的丙酮，搖勻，加1mL的30%過氧化氫，搖勻，再加入無水乙醇2mL，搖勻，預超聲1min去除氣泡，最后用無水乙醇定容至10mL，超聲45min，超聲結(jié)束后搖勻靜止30min，用0.22μm的有機膜過濾即可得到輔酶Q10樣品，再用WATERS-Acquity UPLC進行分析測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波輸出功率對輔酶Q10提取的影響 用超聲波每次輻射/間歇時間為5s/6s、總工作時間為5min、菌液OD為22.3對處理后的發(fā)酵液進行超聲波處理，考察超聲波輸出功率對輔酶Q10提取的影響（圖1）。

由圖1可知當超聲波的輸出功率過小時，對菌體細胞的破碎程度不夠強烈，導致細胞不能被破碎，使細胞內(nèi)的輔酶Q10無法溶解在乙醇中。輸出功率的提高有利于液體中空穴的形成，從而形成更多的空化泡產(chǎn)生空化效應，有利于細胞的破碎。當繼續(xù)提高超聲波功率，發(fā)現(xiàn)超聲波輸出功率在55%時輔酶Q10提取量最高，但是超聲波輸出功率超過55%后，輔酶Q10提取量呈現(xiàn)下降趨勢，分析原因是超聲過程中產(chǎn)生的空化作用對細胞產(chǎn)生了局部的高溫高壓，使得溶液中產(chǎn)生了H·和OH·等自由基[8]，這些強氧化性的自由基會氧化和降解溶液中的輔酶Q10，從而使輔酶Q10提取量下降。因而確定超聲波的最佳輸出功率為55%。

2.2 超聲波每次輻射時間對輔酶Q10提取的影響 用超聲波功率55%、總工作時間為5min、菌液OD為22.3對處理后的發(fā)酵液進行超聲波處理，考察超聲波每次輻射時間對輔酶Q10提取的影響（圖2）。

結(jié)果表明，在超聲條件相同的情況下，每次輻射時間為4s效果最好，此時提取的輔酶Q10量最高。超聲波破碎細胞的過程：超聲波使溶液形成空穴，從而產(chǎn)生空化泡，然后再由空化泡進行震動、膨脹、壓縮和崩潰閉合的過程，這一過程由短暫的時間來完成的，短時多次的工作方式有利于超聲波產(chǎn)生更多的空化泡，有更多的機會完成膨脹和爆炸的過程，因此有利于細胞的破碎[9]。不過當每次輻射時間過短時，輔酶Q10提取量反而下降，這可能是由于輻射時間過短導致超聲波空化作用起不到對細胞爆裂破壁作用所致。當每次輻射時間達到4s時，輔酶Q10提取量最大，當繼續(xù)提高每次輻射時間輔酶Q10提取量卻下降了，這可能是由于輻射時間越長使得超聲波產(chǎn)生的空化作用越強，導致產(chǎn)生的活性氧也越多，輔酶Q10被氧化降解，提取量下降。因此，選擇4s作為超聲波的最佳輻射時間。

2.3 超聲波工作總時間對輔酶Q10提取的影響 用超聲波功率55%、超聲波每次輻射/間歇時間為4s/6s、菌液OD為22.3對處理后的發(fā)酵液進行超聲波處理，考察超聲波工作總時間對輔酶Q10提取的影響（圖3）。

在超聲波其他條件都固定的前提下，隨著工作總時間的提高，輔酶Q10提取量也隨著增加，這是由于工作時間充分，細胞破碎充分，輔酶Q10從細胞中被提取的量也增多，但是隨著工作總時間進一步提高，輔酶Q10的提取量反而下降，這是由于輔酶Q10對光敏感，見光易分解，長時間暴露在空氣中，易被氧化。所以適當提高工作總時間可以提高輔酶Q10提取量，但時間不宜過長，最佳總工作時間為4min。

2.4 菌液濃度對輔酶Q10提取的影響 用超聲波功率55%、超聲波每次輻射/間歇時間為4s/6s、工作總時間為4min，對處理后的發(fā)酵液進行超聲波處理，考察菌液濃度對輔酶Q10提取的影響（圖4）。

從圖中4可以看出隨著菌液濃度的增加，輔酶Q10的提取量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。原因是當菌液濃度很稀時，超聲波在溶液中傳遞的能量損失很大，表現(xiàn)出來的破碎細胞效果也很差，隨著菌液濃度的進一步提高，超聲波傳遞過程的能量進一步減少，輔酶Q10的提取量也增多，但是菌液濃度過稠時，卻不利于超聲波過程中空化泡的形成及膨脹和爆炸，導致細胞的破碎效果不好[10]。

2.5 正交試驗確定最佳提取條件 根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以超聲波輸出功率、每次輻射時間、工作總時間、菌液濃度為主要因素，確定步長和方向，進行4因素3水平的正交試驗（表1），結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，超聲波輸出功率、每次輻射時間、工作總時間對提取效果均有極顯著的影響，菌液濃度對輔酶Q10提取效果影響不顯著。根據(jù)R值比較了各個因素對輔酶Q10提取效果的影響程度依次為超聲波輸出功率>工作總時間>每次輻射時間>菌液濃度，綜合各個因素的k值比較可得A2B1C3D2為最佳破碎條件，即超聲波輸出功率為55%、每次輻射時間為3s、工作總時間為6min、菌液濃度為23.4。在此條件下，輔酶Q10的提取量達到11.86mg/L。

3 小結(jié)

通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了超聲波破碎儀提取輔酶Q10的工藝條件。確定了輔酶Q10最佳提取條件為：超聲波輸出功率為55%、每次輻射時間為3s、工作總時間為6min、菌液濃度OD為23.4。

采用超聲波破碎細胞過程要在冰浴條件下進行，從而降低超聲過程中產(chǎn)生的熱對輔酶Q10的破壞，而且提取輔酶Q10過程應該盡量避光，這是由于輔酶Q10見光易分解。

參考文獻

[1]Lenaz G，F(xiàn)ato R，F(xiàn)ormiggini G，et a1.The role of coenzyme Q in mitochondrial electron transport[J].Mitochondrion，2007，7：8-33.

[2]Kawamukai M.Biosynthesis，bioproduction and novel roles of ubiquinone[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2002，94（6）：511-517.

[3]Wyman M， Leonard M，Morledge T.Coenzyme Q10：a therapy for hypertension and statin-induced myalgia[J].Cleveland Clinic journal of medicine，2010，77（7）：435-442.

[4]李英華.煙草細胞培養(yǎng)生產(chǎn)輔酶Q10 的研究[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學，2009.

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[7]趙樹全，劉悅才，江國托.釀酒酵母菌體中輔酶Q10 的提取及測定方法[J].釀酒科技，2008（11）：114-116.

[8]歐陽琴，陳興才，黃亞治.雨生紅球藻提取蝦青素不同機械破壁方法的研究[J].福州大學學報：自然科學版，2005，33（1）：111-115.

[9]吳克剛，楊連生，黃通旺.超聲波破碎Thraustochyt rium 提取脂質(zhì)的研究[J].鄭州工程學院學報，2001，22（4）：31-34.

[10]傅紹軍，李微，朱利民.瑞士乳酸桿菌搖瓶發(fā)酵條件及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].藥物生物技術(shù)，2005（6）：361-365. （責編：施婷婷）

在超聲波其他條件都固定的前提下，隨著工作總時間的提高，輔酶Q10提取量也隨著增加，這是由于工作時間充分，細胞破碎充分，輔酶Q10從細胞中被提取的量也增多，但是隨著工作總時間進一步提高，輔酶Q10的提取量反而下降，這是由于輔酶Q10對光敏感，見光易分解，長時間暴露在空氣中，易被氧化。所以適當提高工作總時間可以提高輔酶Q10提取量，但時間不宜過長，最佳總工作時間為4min。

2.4 菌液濃度對輔酶Q10提取的影響 用超聲波功率55%、超聲波每次輻射/間歇時間為4s/6s、工作總時間為4min，對處理后的發(fā)酵液進行超聲波處理，考察菌液濃度對輔酶Q10提取的影響（圖4）。

從圖中4可以看出隨著菌液濃度的增加，輔酶Q10的提取量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。原因是當菌液濃度很稀時，超聲波在溶液中傳遞的能量損失很大，表現(xiàn)出來的破碎細胞效果也很差，隨著菌液濃度的進一步提高，超聲波傳遞過程的能量進一步減少，輔酶Q10的提取量也增多，但是菌液濃度過稠時，卻不利于超聲波過程中空化泡的形成及膨脹和爆炸，導致細胞的破碎效果不好[10]。

2.5 正交試驗確定最佳提取條件 根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以超聲波輸出功率、每次輻射時間、工作總時間、菌液濃度為主要因素，確定步長和方向，進行4因素3水平的正交試驗（表1），結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，超聲波輸出功率、每次輻射時間、工作總時間對提取效果均有極顯著的影響，菌液濃度對輔酶Q10提取效果影響不顯著。根據(jù)R值比較了各個因素對輔酶Q10提取效果的影響程度依次為超聲波輸出功率>工作總時間>每次輻射時間>菌液濃度，綜合各個因素的k值比較可得A2B1C3D2為最佳破碎條件，即超聲波輸出功率為55%、每次輻射時間為3s、工作總時間為6min、菌液濃度為23.4。在此條件下，輔酶Q10的提取量達到11.86mg/L。

3 小結(jié)

通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了超聲波破碎儀提取輔酶Q10的工藝條件。確定了輔酶Q10最佳提取條件為：超聲波輸出功率為55%、每次輻射時間為3s、工作總時間為6min、菌液濃度OD為23.4。

采用超聲波破碎細胞過程要在冰浴條件下進行，從而降低超聲過程中產(chǎn)生的熱對輔酶Q10的破壞，而且提取輔酶Q10過程應該盡量避光，這是由于輔酶Q10見光易分解。

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在超聲波其他條件都固定的前提下，隨著工作總時間的提高，輔酶Q10提取量也隨著增加，這是由于工作時間充分，細胞破碎充分，輔酶Q10從細胞中被提取的量也增多，但是隨著工作總時間進一步提高，輔酶Q10的提取量反而下降，這是由于輔酶Q10對光敏感，見光易分解，長時間暴露在空氣中，易被氧化。所以適當提高工作總時間可以提高輔酶Q10提取量，但時間不宜過長，最佳總工作時間為4min。

2.4 菌液濃度對輔酶Q10提取的影響 用超聲波功率55%、超聲波每次輻射/間歇時間為4s/6s、工作總時間為4min，對處理后的發(fā)酵液進行超聲波處理，考察菌液濃度對輔酶Q10提取的影響（圖4）。

從圖中4可以看出隨著菌液濃度的增加，輔酶Q10的提取量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。原因是當菌液濃度很稀時，超聲波在溶液中傳遞的能量損失很大，表現(xiàn)出來的破碎細胞效果也很差，隨著菌液濃度的進一步提高，超聲波傳遞過程的能量進一步減少，輔酶Q10的提取量也增多，但是菌液濃度過稠時，卻不利于超聲波過程中空化泡的形成及膨脹和爆炸，導致細胞的破碎效果不好[10]。

2.5 正交試驗確定最佳提取條件 根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以超聲波輸出功率、每次輻射時間、工作總時間、菌液濃度為主要因素，確定步長和方向，進行4因素3水平的正交試驗（表1），結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，超聲波輸出功率、每次輻射時間、工作總時間對提取效果均有極顯著的影響，菌液濃度對輔酶Q10提取效果影響不顯著。根據(jù)R值比較了各個因素對輔酶Q10提取效果的影響程度依次為超聲波輸出功率>工作總時間>每次輻射時間>菌液濃度，綜合各個因素的k值比較可得A2B1C3D2為最佳破碎條件，即超聲波輸出功率為55%、每次輻射時間為3s、工作總時間為6min、菌液濃度為23.4。在此條件下，輔酶Q10的提取量達到11.86mg/L。

3 小結(jié)

通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了超聲波破碎儀提取輔酶Q10的工藝條件。確定了輔酶Q10最佳提取條件為：超聲波輸出功率為55%、每次輻射時間為3s、工作總時間為6min、菌液濃度OD為23.4。

采用超聲波破碎細胞過程要在冰浴條件下進行，從而降低超聲過程中產(chǎn)生的熱對輔酶Q10的破壞，而且提取輔酶Q10過程應該盡量避光，這是由于輔酶Q10見光易分解。

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[10]傅紹軍，李微，朱利民.瑞士乳酸桿菌搖瓶發(fā)酵條件及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].藥物生物技術(shù)，2005（6）：361-365. （責編：施婷婷）