分子標記在煙草性狀連鎖基因定位中的應用進展

羅昭標，陳歡，毛華，占資撫，王木榮

1.撫州市煙草公司 資溪分公司，江西 撫州 335300；2.南昌工學院 民族教育學院，江西 南昌 330108；3.紅塔遼寧煙草有限責任公司，遼寧 沈陽 110002

煙草是茄科煙屬的重要經濟作物，煙葉是其主要收獲器官。自我國煙草行業大企業、大品牌、大市場發展戰略實施后，為提高優質煙葉供應能力，國家煙草專賣局從2004年開始開展部分替代進口煙葉生產示范工作，2009年6月30日，下發了《國家煙草專賣局關于啟動特色優質煙葉開發重大專項的通知》，標志著涉及煙草工業、商業企業和相關研究機構的特色優質煙葉開發重大專項正式啟動[1]。研究煙草特色優質性狀，如高香氣、高抗病性狀，定位及分析特殊性狀連鎖基因，培育優質煙葉品種，是開發特色優質煙葉，構建中式卷煙優質特色煙葉原料保障體系的重要任務。

煙草性狀基因定位是指將性狀連鎖基因定位于某一特異的染色體上，測定基因在染色體上線性排列的順序和距離[2]。傳統的基因定位主要采用形態性狀的標記及同工酶標記，是對基因的間接反映。而分子標記是DNA水平遺傳變異的直接反映。自1974年Grozdicker等[3]建立了第一個分子標記以來，分子標記在作物遺傳育種中得到廣泛應用。煙草各種分子標記遺傳連鎖圖的相繼建立[4-6]，為煙草性狀的基因定位及分子標記輔助選擇奠定了良好基礎。我們簡要綜述分子標記在煙草化學、普通農藝和抗病性等性狀連鎖基因定位中的應用進展，討論其存在的問題，展望其應用前景，以期為分子標記應用于煙草性狀連鎖基因定位和特色優質煙葉育種分子標記輔助選擇研究提供借鑒。

1 分子標記技術

分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記[2]。現已有幾十種分子標記，按技術基礎可分為基于分子雜交技術、PCR技術、限制性酶切結合PCR技術和DNA芯片技術等4類[7]。常用于煙草研究的分子標記有擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）、簡單重復序列間區（inter-simple sequence repeat，ISSR）、相關序列擴增多態性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）、隨機擴增多態性 DNA（ran?dom amplified polymorphic DNA，RAPD）、特異序列擴增多態性（sequence specific amplification poly?morphism，SSAP）、特征序列擴增區域（sequencecharacterized amplified regions，SCAR）等[8]。

2 煙草化學成分連鎖基因定位

特色優質煙葉具有化學成分、物理特性、內在品質和安全性等方面的特殊性，其中化學成分對物理特性、內在品質和安全性有重要影響。化學成分一般屬于數量性狀，運用分子標記技術建立遺傳連鎖圖做QTL分析，可更精確、有效地選擇最優基因型[9]。

早在2006年，Julio等[10]對烤煙化學成分連鎖基因做了大量工作，通過AFLP、ISSR、SSAP、SCAR分子標記對33個煙草化學指標進行定位，包括近紅外光譜檢測的煙堿、焦油、石油醚提取物、氯、氮、多酚類等18種成分，高效液相色譜檢測的總堿、煙堿、假木賊堿、去氫新煙堿、降煙堿和干物質等6種成分，卷煙相關的CO、焦油、煙堿、總粒相物、苯并［α］芘等9個指標。國內肖炳光等[9]與李華麗等[11]利用ISSR、RAPD、SRAP分子標記分析烤煙品種，分別發現了與總糖、煙堿、氧化鉀3種煙葉化學成分相關的7個加性效應QTL、2個煙堿相關QTL、2個總氯相關QTL、1個總鉀相關QTL。

而針對具有特殊香氣的“大白筋599”，常愛霞[12]用RAPD引物Y466分析了“大白筋599”、一般香氣的“G28”及其Fl和F2的17個單株，結果表明擴增出的多態性片段可能是與“大白筋599”的特殊香氣性狀連鎖的分子標記。

白肋煙是中式混合型卷煙的重要原料，分子標記也逐步用于白肋煙的研究。柴利廣[13]通過SRAP和AFLP分析，發現有2個QTL位點與白肋煙煙堿合成連鎖，1個與總氮含量連鎖，并且3個位點在同一區間。蔡長春等[14]也用上述2種分子標記檢測到與煙堿（2個）、總氮（2個）和總糖（3個）相關的QTL，未檢測到與總鉀相關的QTL。

我國煙草界一直關注卷煙的“減害”，煙草化學成分是卷煙有害成分的來源或前體物。目前化學及物理手段的“減害”逐漸陷入瓶頸，通過基因工程控制煙草有害成分前景廣泛。利用分子標記技術定位有害成分或前體物的控制基因，通過基因工程手段抑制其遺傳表達，可以從根本上降低煙草有害成分。

3 煙草普通農藝性狀連鎖基因定位

煙草的農藝、品質等重要性狀多為數量性狀，易受環境影響，根據表型進行育種選擇效率低。煙草普通農藝性狀連鎖基因定位大多集中于影響煙葉產量的相關性狀研究。

2006年，Julio等[10]分析化學成分連鎖基因的同時，對煙葉采摘時間（5因素）、煙葉采后重量（5因素）、煙葉質量（5因素）、煙葉生長發育（5因素）、腋芽量、田間顏色、開花時間、形態類型、煙莖比重和地面總產量等26個煙草農藝性狀指標進行了定位。

國內煙草研究人員已利用SRAP、SSR、AFLP、ISSR對烤煙株高、莖圍、節距、葉片數、最大腰葉長、最大腰葉寬[15]、中部葉長[14]、莖葉夾角[11]、葉片數、腳葉長、腳葉寬、腰葉長[16]的相關QTL進行定位。張吉順等指出，其研究中與株高、葉片數、腳葉寬和腰葉長穩定關聯的SRAP標記可應用于分子標記輔助選擇及候選基因研究。以上研究均未發現開花天數、成熟天數、頂葉長、頂葉寬、主側脈角、總葉數和中部葉寬相關的QTL。杜傳印[17]和譚效磊[18]采用雜交方法，分別通過AFLP和SSR分析，找到一個與控制白肋型葉色性狀基因相連鎖的AFLP標記，檢測得到易烤性相關的4個QTL。

煙草普通農藝性狀一直是煙農關注的焦點，主要表現為烤煙的煙葉產量和易考性。將分子標記技術應用于提高產量與質量矛盾下的煙葉產量，是一個重要的研究方向。

4 煙草抗病性連鎖基因定位

目前，分子標記技術在煙草抗病性連鎖基因定位中應用最多，抗病性也屬于農藝性狀，由于研究報道較多，因此單獨列出論述。

4.1 煙草真菌病抗性基因定位

煙草常見的真菌病害有根黑腐病、赤星病、黑脛病、炭疽病、猝倒病和霜霉病等，其中煙草霜霉病在我國沒有發生病害。

據現有文獻報道，煙草研究人員利用分子標記分析出了2個對抗煙草根黑腐病RAPD標記[19]、1個抗白粉病相關QTL[11]、3個與抗赤星病相關QTL[20]、1個抗赤星病RAPD標記[21]、1個抗赤星病SSR標記[22]、2個抗黑脛病RAPD標記[23-24]、7個黑脛病抗性相關QTL[25]和1個抗黑脛病SSR標記[26]。以上分子標記均可用于煙草育種中的分子標記輔助選擇。

4.2 煙草細菌病抗性基因定位

煙草常見的細菌病害有青枯病、野火病、角斑病和細菌性黑莖病等，其中研究較多的是煙草青枯病。

Nishi等[27]利用AFLP標記將對應于青枯病抗性的一個QTL位點及與之相聯系的DNA標記定位到一個32 cM長、包含15個標記的連鎖群中，另發現2個共顯性標記M82和M84都與抗性基因連鎖。楊友才等[28]選用高感和高抗青枯病品種進行RAPD分析，篩選出一個與抗青枯病基因連鎖的RAPD片段。

徐秀紅[29]從423個RAPD引物中篩選到與野火病抗性基因緊密連鎖的RAPD標記S522000。Yi等[30]對1500個RAPD引物進行篩選，鑒定了5個與煙草野火病抗性基因連鎖的RAPD標記。Milla等[31]將篩選到的2個煙草霜霉病抗性基因的RAPD標記轉化為SCAR標記，并指出在大田、輔助標記選擇中，這2個SCAR標記可用于鑒定煙草是否有霜霉病抗性。

4.3 煙草病毒病抗性基因定位

煙草常見病毒病有煙草普通花葉病毒（TMV）病、黃瓜花葉病毒（CMV）病、蝕紋病毒病、馬鈴薯Y病毒（PVY）病和番茄斑萎病毒病等。

范靜苑等[32]用135對SSR引物進行分子標記分析，得到標記SM1350與源于鐵把子的CMV抗性基因間的遺傳距離為8.64 cM，標記SM2270與源于臺煙8號的CMV抗性基因間的遺傳距離為3.92 cM。

Noguchi等[33]用只在PVY抗性上有差異的煙草NIL進行RAPD分析，找到10個標記，這些標記只在感病品種中存在，并經過Southern雜交證實。王貴等[34]從多條RAPD引物和一對SCAR引物中，篩選出2個與PVY抗性基因緊密連鎖的分子標記，并指出二者可用于抗PVY抗性育種。

高玉龍等[35]通過分子標記分析結合田間TMV抗性鑒定，發現TMV抗性基因位于標記N2和XS?RP1x26之間，標記與品種（系）的TMV抗性吻合率達97.62%。許石劍[36]分析了Ti245抗TMV的遺傳規律，并對抗性基因進行SSR標記定位，發現Ti245抗TMV的位點位于LG9連鎖群，標記*Tp217200距目的基因最近，遺傳距離為3.3 cM。

Moon和Nicholson[37]利用AFLP建立了3個與煙草番茄斑萎病毒抗性基因緊密連鎖的標記，并進一步轉化為SCAR標記。

4.4 煙草蟲害抗性基因定位

已發現6種煙草線蟲病害，分別是煙草南方根結線蟲病、北方根結線蟲病、爪哇根結線蟲病、花生根結線蟲病、煙草孢囊線蟲病和草原線蟲根褐腐病。

Yi等[38]利用RAPD標記分析根結線蟲抗性基因，將16個RAPD標記定位在24.1 cM距離內的6個位點上，其中6個RAPD標記定位在Rk位點。王揚等[39]發現RAPD引物OPJ13能在所有感根結線蟲病品種中擴增出一條780 bp的片段，而該片段在所有抗病品種的擴增產物中均未發現，因此此標記極有可能是與煙草感病基因相連鎖的分子標記。

煙草病害多達116種以上，僅我國煙草上侵染性病害已達68種以上，且新的病害在不斷增加。煙草病害是影響煙葉產量和質量的重要因素。加強分子標記定位煙草抗性基因，進一步利用基因工程技術培育煙草抗病品種，具有廣闊的發展前景。

5 討論與展望

5.1 加強新型分子標記技術在煙草中的應用

分子標記技術可以運用于煙草品種鑒定、種質資源分析、遺傳分析、基因定位、輔助選擇、病蟲害分析等多方面的研究。從總體上看，分子標記在煙草上的運用，目前取得的進展也還相對落后與其他作物如水稻、小麥等。如穩定性更高的SCAR標記，僅應用于煙草品種鑒定和基因定位等方面[40-41]；多態性豐富的、能反應單核苷酸變異的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）標記，在煙草中的應用尚屬空白[42]。因此，配置相關設備和軟件，加強新型分子標記技術在煙草中的應用，是煙草研究人員的重要任務。

5.2 加強煙草特殊性狀的基因定位與分析

近年來，由于安全性和重金屬等問題，煙草處于輿論漩渦中心。運用分子標記技術加強煙草有害化學成分的連鎖基因研究，開發特色優質、安全性高的煙葉品種，從品種開始“減害降焦”，是煙草農業發展的趨勢。加強煙草高香氣性狀連鎖基因的研究，培育特色香氣煙草品種，對建立特色風格、特色香氣的“中式卷煙”原料基礎具有重要意義。

5.3 加強分子標記在野生煙草性狀中的研究

目前已發現的煙屬作物有66種，其中多數是野生種，被煙草行業栽培利用的只有紅花煙草（Nicoti?ana tabacum L）和黃花煙草（N.rustica L）[43]。雖然野生煙草沒有經濟價值，但其獨有的某些抗病性、香氣成分等性狀是普通煙草所欠缺的。考察野生煙草特殊性狀的優良性，利用分子標記定位其連鎖基因，將其引入普通煙草育種，可為解決我國在煙草育種上面臨的過度依賴主體親本、育成品種遺傳基礎狹窄、主要性狀趨同等問題開辟新途徑。

5.4 加強特殊性狀連鎖基因定位的后續研究

大多數研究集中于定位煙草特殊形狀連鎖基因，對連鎖基因的序列分析、表達形式及作用機理等的研究較少。因此，要進一步加強特殊性狀控制基因定位的后續研究，掌握連鎖基因的作用機理，將其運用到煙草基因工程育種中，為培育高抗性、適合工業需求的新品種提供新途徑。

5.5 加強研究資源的合理配置

目前，國內研究煙草分子標記、基因工程育種的人員較多，高校、研究所、工業及商業企業都有相關研究人員。應合理分配研究資源，避免同類研究，對減少資源浪費，加快研究進度都有重要意義。地方研究人員應注重當地煙草流行病害的研究。

[1]王樹聲.特色優質煙葉開發重大專項立項背景[J].中國煙草科學,2010,31(1):83-84.

[2]趙淑清,武維華.DNA分子標記和基因定位[J].生物技術通報,2000,(6):1-4.

[3]Grodzicker T,Williams J,Sharp P,et al.Physical mapping oftemperature-sensitive mutations ofadenoviruses[J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol,1974,39:439-446.

[4]Lin T Y,Kao Y Y,Lin S,et al.A genetic linkagemap of Ni?cotian aplumbaginifolia/Nicotiana longiflora based on RFLP and RAPD markers[J].Theor Appl Genet,2001,103(6-7):905-991.

[5]Bindler G,van der Hoeven R,Gunduz I.A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J].Theor Appl Genet,2006,l14:341-349.

[6]馬紅勃,祁建民,李延坤,等.煙草SRAP和ISSR分子遺傳連鎖圖譜構建[J].作物學報,2008,34(11):1958-1963.

[7]陳杰,楊靜,郭鴻雁,等.DNA分子標記技術在煙草遺傳育種中的應用[J].中國農學通報,2012,28(7):95-99.

[8]徐秀紅,王洪剛,王元英.分子標記技術在煙草抗病蟲害研究中的應用進展[J].中國煙草學報,2004,10(6):33-38.

[9]肖炳光,盧秀萍,焦芳蟬,等.烤煙幾種化學成分的QTL初步分析[J].作物學報,2008,34(10):1762-1769.

[10]Julio E,Denoyes-Rothan B,Verrier J L,et al.Detection of QTLs linked to leaf and smoke properties in Nicotiana taba?cum based on a study of 114 recombinant inbred lines[J].Mol Breed,2006,18:69-91.

[11]李華麗,陳美霞,周東新,等.煙草六個重要性狀的QTL定位[J].作物學報,2011,37(9):1577-1584.

[12]常愛霞.特香型烤煙主要致香物質檢測和香氣性狀遺傳研究[D].北京:中國農業科學院,2002.

[13]柴利廣.白肋煙遺傳連鎖圖譜的構建及煙堿含量QTL的定位[D].武漢:華中農業大學,2008.

[14]蔡長春,柴利廣,王毅,等.白肋煙分子標記遺傳圖譜的構建及部分性狀的遺傳剖析[J].作物學報,2009,35(9):1646-1654.

[15]童治軍,焦芳嬋,吳興富,等.烤煙6個農藝性狀的QTL定位[J].作物學報,2012,38(8):1407-1415.

[16]張吉順,王仁剛,楊春元,等.國內外烤煙品種農藝性狀的遺傳多樣性及與SRAP標記的關聯分析[J].作物學報,2012,38(6):1029-1041.

[17]杜傳印.白肋型煙草葉色基因的分子標記與煙草種質遺傳多樣性研究[D].泰安:山東農業大學,2006.

[18]譚效磊,徐秀紅,王暖春,等.烤煙易烤性QTL定位分析[J].分子植物育種,2012,10(2):201-206.

[19]Bai D,Reeleder R,Brandle J E.Identification of two RAPD markers tightly linked with the Nicotiana debneyi for resis?tance to blackroot rot of tobacco[J].Theor Appl Genet,1995,91(8):1184-1189.

[20]焦天雷.煙草(Nicotiana tabacum L.)赤星病抗性QTL的定位分析[D].杭州:浙江大學,2011.

[21]郭生云,何川生,張漢堯,等.用RAPD技術鑒定烤煙抗赤星病基因連鎖標記[J].海南師范學院學報(自然科學版),2001,14(2):10-13.

[22]蔣彩虹,羅成剛,任民,等.一個與凈葉黃抗赤星病基因緊密連鎖的SSR標記[J].中國煙草科學,2012,33(1):19-22.

[23]汪安云,肖炳光,李天飛,等.烤煙品種的RAPD引物篩選[J].中國煙草學報,2000,6(4):7-11.

[24]Johnson E S,Wolff M F,Wernsmann E A.Marker-assisted selection for resistance to black shank disease in tobacco[J].Plant Disease,2002,86:1303-1309.

[25]陳迪文,柴利廣,蔡長春,等.白肋煙遺傳連鎖圖的構建及黑脛病抗性QTL初步分析[J].自然科學進展,2009,8:852-858.

[26]張潔霞.抗煙草黑脛病分子標記的篩選及抗性遺傳規律的研究[D].長沙:湖南農業大學,2009.

[27]Nishi T,Tajima T,Noguchi S.Identification of DNA markers of tobacco linked to bacterial wilt resistance[J].Theor Appl Genet,2003,106:765-770.

[28]楊友才,周清明,朱列書.煙草青枯病抗性基因的遺傳分析及RAPD標記[J].中國煙草學報,2006,12(2):38-42.

[29]徐秀紅.煙草野火病的抗性鑒定及其抗性基因的分子標記與輔助選擇[D].泰安:山東農業大學,2005.

[30]Yi Y H,Rufty R C,Wernsman E A.Identification of RAPD markers linked to the wild fire resistance gene of tobacco us?ing bulked segregant analysis[J].Tob Sci,1998,42:52-57.

[31]Milla S R,Levin J S,Lewis R S,et al.RAPD and SCAR markers linked to an introgressed gene conditioning resistance to peronospora tabacina D.B.adam.in tobacco[J].Crop Sci?ence,2005,45:2346-2354.

[32]范靜苑,王元英,蔣彩虹,等.煙草CMV抗性鑒定及抗性基因的SSR標記研究[J].分子植物育種,2009,7(2)355-359.

[33]Noguchi S,Tajima T,Yamamoto Y,et al.Deletion of a large genomic segment in tobacco varieties that are resistant to po?tato virus Y(PVY)[J].Mol Gen Genet,1999,262(4-5):822-829.

[34]王貴,劉勇,盧秀萍,等.煙草PVY抗性的遺傳分析與分子標記篩選[J].分子植物育種,2012,10(1):97-103.

[35]高玉龍,肖炳光,童治軍,等.煙草抗TMV基因連鎖分子標記的篩選及在抗病資源篩選中的應用[J].分子植物育種,2011,9(5):585-591.

[36]許石劍,肖炳光,高玉龍,等.煙草Ti245抗煙草花葉病毒的遺傳分析及抗性基因定位[J].湖南農業大學學報(自然科學版),2011,37(2):123-126.

[37]Moon H,Nicholson J S.AFLP and SCAR markers linked to tomato spotted wilt virus resistance in tobacco[J].Crop Sci?ence,2007,47:1887-1894.

[38]Yi Y H,Rufty R C.RAPD markers elucidate the origin of the root-knot nematode resistance gene(Rk)in tobacco[J].Tob Sci,1998,42(3):58-63.

[39]王揚,喻盛甫,胡先奇.對根結線蟲抗病及感病煙草品種的RAPD分析[J].沈陽農業大學學報,2001,32(3):218-219.

[40]馬林,羅昭標,羅華元,等.煙草品種的SCAR標記鑒別[J].中國煙草學報,2012,18(5):27-32.

[41]Julio E,Verrier J L,de Borne F D,et al.Development of SCAR markers linked to three disease resistances based on AFLP within Nicotiana tabacum L[J].Theor Appl Genet,2006,112:335-346.

[42]任民,王志德,張興偉,等.基于公共數據庫的煙草編碼序列SNP位點發掘[C]//中國作物學會50周年慶祝會暨2011年學術年會論文摘要集.成都:中國作物學會,2011:43.

[43]Lin T Y,Kao Y Y,Lin S,et al.A genetic linkage map of Nicotiana plumbaginifolia/Nicotiana longiflora based on RFLP and RAPD markers[J].Theor Appl Genet,2001,103:905-911.