添加三種外源蛋白研制生物有機肥及其促生效果

張 苗， 施娟娟， 曹亮亮， 李 榮， 張 楊， 梁曉琳， 沈其榮

(農業部長江中下游植物營養與肥料重點實驗室， 江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術研究重點實驗室，江蘇省協同創新中心， 南京農業大學資源與環境科學學院， 江蘇南京 210095)

生物有機肥是指特定功能微生物與主要以動植物殘體(如畜禽糞便、農作物秸稈等)為來源并經無害化處理、腐熟的有機物料復合而成的一類兼具微生物肥料和有機肥效應的肥料[1]。此類肥料含有大量具特定功能的微生物，其生命活動是生物有機肥優于普通有機肥的關鍵因素。生物有機肥具有減少或代替部分化肥、農藥的使用[2-3]，增強作物抗逆性[4-5]，改善作物品質[6-7]，改良土壤[8-9]等優勢，已經越來越多地被人們所認可并在生產上廣泛應用。目前，多以秸稈、雞糞、酒糟、牛糞、豬糞或葛根菌糠等單一的固體廢棄物為有機載體來發酵功能微生物研制生物有機肥[10]，也有一些高端生物有機肥會在畜禽糞便等固體廢棄物的基礎上添加一定的氨基酸材料促進功能微生物發酵、提高肥料品質，常用的氨基酸添加材料為菜粕[11-12]，大量的研究中菜粕的添加量已經達到50%，雖肥料效果很好，但由于菜粕成本較高，導致該類生物有機肥雖具優異的效果，但大面積推廣受到限制。因此，考慮開發更多的廉價蛋白源固體廢棄物作為生物有機肥生產中的外源添加氨基酸來代替部分菜餅，在確保生物有機肥品質的前提下大幅度降低肥料成本，將為生物有機肥產業快速發展提供保障。

畜禽糞便經過一次高溫發酵后形成的腐熟堆肥，加入外源氨基酸接種植物根際促生菌后，經過短期發酵可研制成兼具有機肥和微生物肥效果的高效肥。本研究選擇腐熟的牛糞有機肥為基本有機載體，藻泥、菜粕、羽毛粉三種蛋白質資源為外源添加劑，添加固態發酵BacillusamyloliquefaciensSQR9，研制含PGPR的生物有機肥；同時通過盆栽試驗研究該生物有機肥對植株苗期的促生效果，以期為資源化利用以上廢棄物和新型生物有機肥的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

具拮抗和促生功能的根際功能菌BacillusamyloliquefaciensSQR9(SQR9)由江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術研究重點實驗室篩選保存[16]。功能菌SQR9種子懸液的制備：采用液體LB培養基，在30℃、 170 rpm搖床條件下培養12 h的SQR9種子發酵液，按照5%的量接入到液體LB培養基中，相同條件下搖床培養36 h。

盆栽黃瓜品種為津春四號、茄子品種為江蔬蘇琦茄。盆栽土壤基本性狀為pH 6.39、有機碳含量為28.69 g/kg、速效氮 79.41 mg/kg、速效磷 25.77 mg/kg、速效鉀 59.44 mg/kg。

1.2 菌株SQR9的計數方法

菌株SQR9采用選擇性培養基：蛋白胨 10 g、酵母粉 5 g、NaCl 10 g、瓊脂 2.5%、去離子水 1000 mL，1%多粘菌素2 mL/L、1%放線菌酮4 mL/L[17]。功能菌SQR9數量采用梯度稀釋平板計數法，將肥料樣稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等不同梯度稀釋液。用無菌吸管各取0.1 mL涂布于相應培養基平板中，不同梯度各三個平板，涂布均勻，于30℃培養箱中培養36 h后計數。功能菌數量以每克肥料干重計算，以cfu/g 干重表示。

1.3 條件單因素試驗的設計

功能菌SQR9接種量的確定：牛糞有機肥添加量85%，菜粕、羽毛粉和藻泥添加量均為5%，固體發酵含水量40%，接種量設為2.5%、5%、7.5%、10%和15%(V/W，體積質量比)，發酵溫度室溫(30±2℃)；固態發酵條件同上。

1.4 三因素水平的確定

菜粕參試水平確定：藻泥5%，羽毛粉5%，菜粕含量設為1%、5%、10%、15%、20%和25%六個水平。藻泥參試水平確定：菜粕5%，羽毛粉5%，藻泥含量設為1%、3%、5%、7%、9%和11%六個水平。羽毛粉參試水平確定：菜粕5%，藻泥5%，羽毛粉含量設為1%、5%、10%、15%、20%和25%六個水平。其他發酵條件同上。

1.5 正交試驗

對藻泥、菜粕、羽毛粉三因素選取的三水平，采用三因素三水平的固態發酵正交試驗選擇最佳配方組合，采用L9(34)正交表安排試驗。

1.6 游離氨基酸和短肽含量測定

總游離氨基酸和短肽含量測定方法參考Airhart等[18]，方法稍加修改。肥料和0.1 M的HCl以1 ∶10的比例混合，室溫150 rpm震蕩1 h后，6000 rpm離心10 min取上清，茚三酮測定法測定總游離氨基酸和短肽含量。

1.7 盆栽試驗

1.8 數據分析

采用Excel 2003和SPSS 18.0軟件進行數據統計分析，使用最小顯著差異法(Least significant difference, LSD) 檢驗進行多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 含水量和接種量對菌株SQR9固態發酵的影響

不同的含水量對菌株的固態發酵效果如圖1A所示，40%的含水量最適于菌株SQR9的固態發酵，發酵效果顯著高于其他處理；含水量高于45%后，隨著含水量的升高菌株SQR9的菌落數顯著下降，高于50%后，處理間無顯著性差異；含水量為30%和35%時，菌株的發酵效果無顯著性差異。因此，后續試驗含水量均設為40%。

不同的初始接菌量對菌株的固態發酵效果如圖1B所示，隨著接菌量的提高，功能菌SQR9的菌落數逐漸提高，但當接菌量大于7.5%時，接菌量對最終肥料中的功能菌活菌數無顯著性影響，從生產成本考慮，后續試驗的初始接菌量為7.5%。

圖1 發酵含水量(A)、接種量(B)對SQR9菌落數的影響Fig.1 The cell density of strain SQR9 under different moisture contents (A) and the initial inoculation (B)

2.2 三因素水平選擇

在含5%菜粕和5%羽毛粉的混合堆體中添加不同含量藻泥對功能菌的發酵效果如圖2A所示，在添加量低于7%時，隨著藻泥加入量的增加，功能菌數量逐漸增多；高于7%時，隨著藻泥加入量的增加，功能菌數量逐漸減少；藻泥添加量為7%時，功能菌數量達到1.93×108cfu/g，其與5%添加量的發酵效果無顯著差異。從功能菌的固態發酵數量和資源化廢棄藻泥的需要兩方面考慮，本研究最終選擇5%、7%、9%為正交參試水平。

在5%藻泥、5%羽毛粉的基礎上加入不同含量菜粕的發酵效果如圖2B所示，隨著菜粕含量的增加，SQR9的菌數隨之增加。當菜粕含量達到10%時，功能菌增加幅度降低，菜粕含量10%條件下發酵菌數達到2.35×108cfu/g， DW，25%條件下發酵菌數達到2.78×108cfu/g， DW，無倍數增加。考慮到菜粕的成本問題，選擇正交因素水平為8%、10%、12%。

在5%菜粕、5%藻泥的基礎上加入不同含量的羽毛粉，結果如圖2C所示，隨著羽毛粉含量的增加，菌株SQR9菌落數隨之增加，在含量達到15%時菌落數達到最多，之后，隨著羽毛粉的增加菌數降低。最終以15%為界點，選擇正交因素水平為12%、15%、18%。

圖2 不同含量藻泥(A)、菜粕(B)、羽毛粉(C)對SQR9發酵菌落數的影響Fig.2 The cell density of strain SQR9 under different algal sludge(A), rapeseed cake (B) and feather powder(C) amounts

2.3 正交試驗結果

為進一步優化發酵配方，對發酵的三種外源添加原料進行三因素三水平正交試驗(表1)。結果如表2所示，由表2的直觀分析結果顯示，A因素的極差最大，B因素、C因素次之，因此，影響菌株SQR9菌落數各因素順序為A>B>C，藻泥的影響最大，其次為菜粕，而羽毛粉影響最小。試驗結果的方差分析結果表明，不同水平的藻泥和菜粕對功能菌發酵菌落數有顯著性影響(P<0.05)，而羽毛粉影響則較小，未達到顯著性(表3)。統計分析結果可得最優水平組為A1B1C1，即藻泥5%、菜粕8%、羽毛粉12%。

表1 L9(34)正交試驗表頭設計表

2.4 不同施肥處理對黃瓜、茄子生長的影響

盆栽試驗中新型生物有機肥配方(BIO)、普通生物有機肥(BOF)以及有機肥(OF)對黃瓜、茄子株高、莖圍、SPAD值的影響如圖3、圖4所示。圖3結果顯示，移栽20天時，BIO處理的黃瓜株高和莖粗顯著高于OF對照，與BOF相比無顯著性差異，BOF處理的植株株高和莖粗均高于OF對照，二者之間無顯著性差異，各處理間的SPAD值也無顯著性差異；移栽30天時，BIO處理的株高和莖粗均顯著高于其他兩個處理，BOF處理的株高顯著高于OF對照，莖粗高于OF對照但無顯著性差異，各處理間的SPAD值同樣無顯著性差異；移栽40天時，BIO處理的株高與BOF處理和OF對照株高的差距增大且存在顯著性差異，其株高分別比BOF、OF高出15.51%、23.57%，BOF處理的植株株高和莖粗均高于OF對照，SPAD值在40天時，BIO處理顯著高于BOF處理和OF對照。圖4結果顯示，茄子移栽20天、30天、40天，BIO處理的株高、莖粗均顯著高于BOF和OF對照； 40天時，BIO株高、莖粗相對BOF分別增加35.89%、10.36%，與OF相比，BOF處理的株高和莖粗雖無顯著性差異，但均高于OF對照，仍具有一定促生效果，移栽40 d時，BIO處理的SPAD值顯著高于BOF處理和OF對照。

表3 菌株SQR9菌落數方差分析

圖3 不同施肥處理對黃瓜株高、莖粗、SPAD的影響Fig.3 Effects of different fertilizer treatments on cucumber height, stem diameter and SPAD

圖4 不同施肥處理對茄子株高、莖粗、SPAD值的影響Fig.4 Effects of different fertilizer treatments on eggplant height, stem diameter and SPAD

移栽40 d，不同施肥處理對兩種植株生物量的影響如表4所示。BIO處理與BOF處理和OF對照相比，黃瓜和茄子地上部鮮重、干重，地下部鮮重均存在顯著性差異。BIO處理的黃瓜地上部鮮重、地下部鮮重、地上部干重和地下部干重比BOF處理分別增加了51.15%、 19.59%、 5.49%和17.75%，比OF處理分別增加了65.56%、 33.49%、 18.90%和37.96%。BIO處理的茄子地上部鮮重、 地下部鮮重、 地上部干重和地下部干重比BOF處理分別增加134.29%、 29.73%、 70.28%和40.34%，比OF處理分別增加154.07%、 38.03%、 76.79%和73.96%?？梢娦滦蜕镉袡C肥促生效果顯著高于普通的生物有機肥和有機肥。

盆栽試驗中BOF、BIO處理肥料基本理化性質如表5。與BOF處理相比，外源氨基酸的添加一方面促進了功能菌的固態發酵，BIO處理中的菌落數為BOF處理中的12.13倍；同時肥料中N和P養分的含量分別增加了1.5個百分點和0.41個百分點，且游離氨基酸和短肽總含量(TAPS)遠遠高于BOF處理。

表4 不同施肥處理對黃瓜、茄子生物量的影響

表5 生物有機肥基本理化性質

3 討論與結論

正交試驗結果表明，藻泥是影響功能菌發酵的主要因素，菜粕其次，羽毛粉對功能菌的發酵沒有顯著影響。藻泥成為發酵的主要因素，推測是由于藻泥富含大量易于微生物利用的營養物質，所用藻泥在打撈站已堆放一個多月，部分物質可能已經初步分解，從而有助于功能菌增殖。菜粕同樣是影響功能菌增殖的主要因素，菜粕堆肥作為一種優質的外源添加氨基酸，由于其富含氨基酸及活性多肽，具有碳源活性高、氮素有效性高的特性[27]，已經被廣泛證明能夠推動功能菌的固態發酵[11]。膨化羽毛粉對于功能菌株的發酵影響最小，可能是因為羽毛粉中大量的角蛋白由于二硫鍵的交聯作用成為了復雜的三維網狀結構，難以被微生物降解所導致[28]。

盆栽試驗結果表明，在氮磷鉀養分補齊的前提條件下，與腐熟牛糞有機肥相比，普通生物有機肥在各項促生指標上雖沒有達到顯著性差異，但促生效果仍然優于普通有機肥，推斷是由于生物有機肥中含有更大量的功能菌BacillusamyloliquefaciensSQR9，該菌株首次被鑒定為Bacillussubtilis，目前根據全基因組的分析，已被重新歸類為Bacillusamyloliquefaciens，菌株的促進植物生長的效果已經被證明[29]；含外源氨基酸研制的生物有機肥的促生效果顯著優于普通生物有機肥和有機肥，這可能是由于該肥料中不僅含有大量的功能微生物，同時外源蛋白的添加增加了肥料中的養分、游離氨基酸和短肽的含量，氨基酸已經被廣泛證明能夠有效促進植物的生長[30, 31]。

本研究結果表明，根際促生菌SQR發酵基本條件為含水量40%、接菌量7.5%，正交配方組合為藻泥5%、菜粕8%、羽毛粉12%、牛糞75%。本研究初步開發了藻泥和羽毛粉兩種廢棄蛋白資源和菜粕為固態發酵添加劑，發酵功能菌研制生物有機肥的新配方，此新型的生物有機肥的生產，能夠在保證肥料效果的前提下，大幅度降低生物有機肥料的成本，研究結果同時能夠為該類廢棄資源的循環利用提供理論依據。

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