模擬人工濕地中硫酸鹽氯霉素處理對細菌數量、濕地酶活性和生化作用的影響

孫雪姣， 徐婷婷， 葉海冬， 都李萍， 應 杰， 章曉凝， 李 鑫， 張崇邦

(浙江省臺州學院生命科學學院， 浙江椒江 318000)

細菌群落在調節碳、氮和磷循環，以及污染物在人工濕地中的滯留和去除中發揮著重要的作用[1-2]。因而幾乎從人工濕地技術開始興起之時，細菌便被看作是該技術的支撐基石[3]。

在一些特殊的廢水如醫療廢水中，許多微生物抑制劑如殺蟲劑和殺細菌劑與其它污染物共存[4]，因此在廢水處理過程中由于抑制劑的作用導致細菌等微生物喪失是不可避免的。同時在人工濕地基質中，一些酶如葡萄糖苷酶、轉化酶、纖維素酶、蛋白酶、脲酶和磷酸酶主要來自于細菌的分泌[5]。另外，一些物質轉化過程如污染物的降解與轉化(氨化、硝化、反硝化、厭氧氨氧化等)也主要是由細菌驅動的[6-7]。所以細菌喪失可能會對人工濕地基質中的酶活性以及一些重要的物質轉化過程產生影響。然而到目前為止，由于在人工濕地中微生物群落之間的相互作用相當復雜，所以細菌喪失最優先地影響哪些酶的活性或物質轉化過程尚不清楚。

目前，通過利用一些窄譜性抗生素如鏈霉素等有選擇性地從環境中去除某一類微生物已成為估測具體微生物群功能的一個重要研究手段[8]。例如Beare等[9]發現當硫酸鏈霉素應用于土壤后，凋落物的降解速率有明顯的下降。Austin等[10]將三氯甲基吡啶應用于土壤中，結果發現土壤的硝化作用有效地降低了。總之選擇性抑制是一種研究微生物群在土壤等環境中發揮具體功能的重要手段。

為了估測人工濕地中細菌在調節酶活性和生化過程中的作用，本研究構建了30個垂直流模擬人工濕地系統，以硫酸鹽鏈霉素作為細菌抑制劑，調查人工濕地中，哪些酶活性或生化作用隨硫酸鏈霉素濃度的增加而優先被抑制，進而為了解細菌在人工濕地廢水凈化過程中所發揮的作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究地區水熱條件

1.2 濕地構造和運行方式

本文的濕地類型為垂直流模擬人工濕地系統，每個模擬濕地單元用PVC管構建，每個單元具體維數為直徑為0.16 m，高為1.2 m，容積為0.02 m3。填料自上而下分別包括細砂層(1—2 mm)、粗砂層(6—12 mm)和鵝卵石層(50—120 mm)三層，其中細砂層的鋪設高度為0.40 m，粗砂層為0.30 m，鵝卵石層為0.20 m。細砂層上部保留30 cm以便灌水。另外在細砂層30 cm處安裝側壁管(直徑 = 6.5 cm)1個，以便樣品采集。濕地栽培植物為香附子 (CyperusrotundusL.)。

廢水為養豬場排出液，灌溉方式為間歇式進水，廢水載荷量為0.01 m3/單元濕地，廢水的滯留時間為7 d，排空時間為0.5 d。濕地運行期間，每天均要檢查植物生長情況和水量情況，如有其它植物入侵或水面高度由于蒸發降低，應隨時剔除植物和補充水量。

1.3 硫酸鏈霉素抑菌處理

以未處理的濕地為對照(0 mg/kg)，設置硫酸鏈霉素5個濃度處理，分別為1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0 mg/kg填料，每個濃度均重復5個濕地單元。

1.4 樣品采集與測定

在每個濕地中，從側壁管收集細砂樣品(500g)，馬上過2 mm篩。每份篩好的樣品裝入塑料袋內，做好標記，運回實驗室，保存于4℃保鮮柜中。

1.4.1 細菌數量分析 不同處理濃度下細菌數量的測定采用稀釋平板法[12]。首先將每個沙子樣品用無菌生理鹽水(0.85%的NaCl溶液)稀釋到10-6，制成沙子懸液。然后將10-6沙子懸液接種到牛肉膏-蛋白胨平板培養基中，并倒置培養在37℃的恒溫培養箱中。24h培養結束后，對平板上的細菌菌落進行計數，最后換算成每克沙子中的細菌個數。

1.4.2 酶活性分析 CMC纖維素酶、蔗糖酶、β-葡糖糖苷酶、蛋白酶、脲酶、硝酸還原酶和酸性磷酸酶活性的測定分別采用蒽酮比色、磷鉬酸比色、P-硝基酚比色、Folin-Ciocalteu’s酚比色、奈氏比色、 磺胺-萘基乙二胺鹽酸鹽比色和P-硝基苯磷酸鈉比色法進行。具體測定步驟詳見許光輝和鄭洪元推薦的方法[12]。

1.4.3 生化作用指標分析 生化作用包括纖維素降解作用、氨化作用、硝化作用、反硝化作用、有機磷降解作用和無機磷轉化作用。纖維素降解作用采用埋布片法測定，其它指標的測定主要采用室內土壤培養法[11]。

試驗數據均采用SPSS 11.5統計軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 硫酸鏈霉素處理濃度對濕地細菌數量和酶活性的影響

為了驗證硫酸鏈霉素處理對濕地細菌的抑制作用，首先測定了各處理濃度濕地中的細菌數量。從圖1可以看出，隨著鏈霉素濃度的增大，細菌數量的平均值(即盒子的中線)顯著下降(P<0.05)，表明鏈霉素處理對細菌有明顯的抑制效果。

圖1 硫酸鏈霉素處理濃度與細菌數量的關系Fig.1 The relationships between sulfate streptomycin treatment concentration and bacterial number

圖2 硫酸鏈霉素處理濃度與纖維素分解酶、葡萄糖苷酶和蛋白酶活性的關系Fig.2 Relationships between sulfate streptomycin treatment concentrations and cellulose, glucosidase and protease activities

2.2 硫酸鏈霉素處理濃度對濕地主要生化反應的影響

2.3 濕地酶活性和生化作用的主成分分析

主成分分析(PCA)是一種降維統計方法，以所有原始參數為自變量，進行多元線性回歸分析，將所得到的因變量稱作主成分，如此進行多次回歸分析后，可以得到若干個主成分，但每個主成分所反映的原始參數的綜合信息量各不相同。一般將反映信息量(即貢獻率)最大的主成分稱作第一組分(PC1)，其次稱作第二組分(PC2)。因而為了進一步了解上述7種酶活性總體變化對硫酸鹽鏈霉素處理濃度的區分能力，對7種酶活性活性數據進行了主成分分析，結果(圖5)表明，沿著橫坐標軸的正方向(PC1在反映酶活性總體變化方面的貢獻率為38.2%)，7種酶活性在主成分PC1上的分值載荷將6個處理明顯地分為兩組， 有硫酸鹽鏈霉素處理的濕地(5個處理梯度)歸為一組，而沒進行硫酸鹽鏈霉素處理的濕地則獨立成另一組。不同濃度硫酸鹽鏈霉素處理的濕地之間沒有分開。主成分矩陣表明，上述這種歸類的產生主要與酸性磷酸酶活性有關(r= 0.885)， 其次是蔗糖酶活性(r=-0.726)和硝酸鹽還原酶活性(r=0.721)。

類似于酶活性的分析，對6種生化作用也進行了主成分分析(圖6)。在PCA的分析結果中，前兩個主成分對生化作用總體變化的貢獻率分別為45.5%和18.6%。不同于酶活性的PCA，沿著橫坐標軸的正方向主成分PC1上的分值載荷將6個處理明顯地分為三組：硫酸鹽鏈霉素處理濃度3.0 mg/kg的濕地歸為一組，處理濃度1.0、 1.5、 2.0和2.5 mg/kg的濕地歸為另一組，而沒進行硫酸鹽鏈霉素處理的濕地則獨立一組。主成分矩陣表明上述這種歸類的產生主要與反硝化作用(r=0.926)和硝化作用(r=0.815)的變化有關，其次是有機磷降解作用(r=-0.795)和氨化作用(r=0.689)。

3 討論

類似于土壤，人工濕地填料中的酶也是一種生物催化劑，其主要功能是加速人工濕地有機與無機化合物的降解和轉化[12]。酶主要來自于土壤微生物、動物細胞和植物根系的分泌以及生物細胞自溶后的釋放[13]。纖維素分解酶、葡萄糖苷酶和蛋白酶主要催化纖維素、葡萄糖苷和蛋白質的降解，而脲酶、硝酸鹽還原酶和酸性磷酸酶主要催化尿素、硝酸鹽和有機磷化合物的轉化和降解[12]。在本研究中，隨著鏈霉素濃度逐漸提高，細菌數量受到抑制，脲酶、硝酸鹽還原酶和酸性磷酸酶活性顯著下降，纖維素分解酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶活性無明顯變化，表明脲酶、硝酸鹽還原酶和酸性磷酸酶的來源和數量主要由細菌所控制，纖維素分解酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶可能由于其是非細菌來源[14]，對細菌數量的改變沒有反應。

圖3 硫酸鏈霉素處理濃度與脲酶、硝酸鹽還原酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性的關系Fig.3 Relationships between sulfate streptomycin treatment concentration and invertase, urase, acid phosphatase and nitrate reductase activities

圖4 硫酸鏈霉素處理濃度與生化作用的關系Fig.4 Relationships between sulfate streptomycin treatment concentration and biochemical transformations

圖5 硫酸鏈霉素處理濃度對酶活性總體變化影響的主成分分析Fig.5 Principal components analysis against effects of sulfate streptomycin treatment concentration on the total changes in enzyme activities

圖6 硫酸鏈霉素處理濃度對生化作用總體變化影響的主成分分析Fig.6 Principal components analysis against effects of sulfate streptomycin treatment concentration on the total changes in biochemical transformations

蔗糖酶(也稱轉化酶)的作用是催化蔗糖分解成葡萄糖和果糖，主要來源于植物和真菌，其次是細菌[15]。在本研究中，一個非常有趣的發現是，隨著細菌數量的減少，蔗糖酶活性顯著提高?？赡苁请S著細菌數量逐漸被抑制，細菌對蔗糖的利用強度相應減弱，濕地填料中的蔗糖濃度有所提高，導致蔗糖酶活性得以提高。由于蔗糖酶主要來源之一是真菌，隨著細菌數量逐漸抑制，細菌和真菌之間的競爭減弱，有利于真菌的生長繁殖，最終使填料中的蔗糖酶活性提高。

物質循環與能量流動是通過微生物驅動的一系列生化作用來實現的，所以研究濕地中細菌與各生化作用的關系對于進一步認識細菌在污染物凈化中的作用具有一定意義[11]。在本研究中，對纖維素降解作用、氨化作用、硝化作用、反硝化作用、無機磷轉化作用和有機磷降解作用進行了測定， 結果顯示，纖維素降解作用和無機磷轉化作用沒有隨著硫酸鏈霉素處理濃度發生明顯改變，最有可能的原因是由于纖維素屬于難降解的大分子有機物，其降解主要由真菌和原生動物來完成[12]。而無機磷轉化作用的主要功能是將難溶的無機磷化合物轉化為可溶解的無機磷化合物，該過程雖然也與細菌(如溶磷細菌)等微生物分泌有機酸的量有關，但與植物分泌的有機酸以及土壤中的腐殖酸含量關系更加密切[11]。正如我們預期的那樣，細菌生長被抑制導致氨化作用、硝化作用、反硝化作用和有機磷降解作用的下降，表明細菌在人工濕地的氮和有機磷凈化過程中確實發揮著重要作用。

另外，主成分分析表明，酶活性的總體變化僅僅區分了鏈霉素處理和未處理的濕地單元，并沒有顯著區分不同濃度鏈霉素處理濕地。然而生化作用不僅有效地區分了不同濃度鏈霉素處理和未處理的濕地單元，而且更重要的是也區分了經不同濃度鏈霉素處理的濕地單元。以往的研究主張將土壤酶活性作為反映環境變化的最敏感指標[16-17]，但本研究結果卻表明土壤生化作用的總體變化在區分鏈霉素處理濕地單元時更敏感。

4 結論

本研究突出了細菌在人工濕地氮和有機磷凈化方面的重要性，因為細菌的逐漸抑制導致了與氮和磷循環有關的酶以及生化作用顯著減低。土壤生化作用的總體變化在區分鏈霉素處理濃度時要比酶活性敏感，這一規律是否具有普遍性還需進一步驗證。

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