嬰幼兒配方乳粉中生物素的測定能力驗證結(jié)果分析

陰甜甜，張璐，張瑩瑩，李軻

1. 河南德仕人力資源服務(wù)有限公司（鄭州 450003）；2. 鄭州海關(guān)技術(shù)中心（鄭州 450003）

生物素（Biotin）又被稱為維生素B7、維生素H、輔酶R（Coenzyme R）等，是一種人體無法自身合成、機體機能所必需的水溶性B族維生素，長期缺乏會導(dǎo)致一系列的缺乏癥，常以皮膚、黏膜和神經(jīng)系統(tǒng)損害為主[1-2]。尤其是嬰幼兒腸道功能較弱，缺乏生物素容易患皮炎、舌炎，甚至引起嚴重的神經(jīng)癥狀，所以，常在嬰幼兒食品中添加生物素[3]。我國對食品標簽有嚴格規(guī)定，標準中要求在產(chǎn)品有效期內(nèi)，營養(yǎng)成分與能量的實際含量要高于標示值的80%[4]。生物素作為嬰幼兒乳粉中重要添加物質(zhì)，是我國重點監(jiān)管對象。

能力驗證是指借助實驗室之間的對比判斷其檢測、校準等能力，是判斷和監(jiān)控實驗室技術(shù)能力、改進質(zhì)量管理體系的有效手段，是重要的實驗室外部質(zhì)量控制方法[5]。通過能力驗證可以讓各個實驗室發(fā)現(xiàn)自身存在的問題，對實驗室人員能力的評價、數(shù)據(jù)與結(jié)果準確性的評價、方法的驗證等都有很大意義。CNAS-RL02：2018《能力驗證規(guī)則》中規(guī)定：食品微生物領(lǐng)域的能力驗證最低參加頻次為1次/年以上[6]。

為檢測實驗室是否掌握配方乳粉中生物素的檢測能力，實驗室參加市場監(jiān)管總局組織的嬰幼兒配方乳粉中生物素的測定檢測能力驗證活動。實驗室嚴格按照GB 5009.259—2016《食品安全國家標準 食品中生物素的測定》[7]，對配方乳粉中生物素含量進行檢測。通過對能力驗證的測定過程及結(jié)果進行總結(jié)分析，為后期檢測工作的開展提供依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品NLYZ-YP-058和NLYZ-YP-109（樣品基質(zhì)為嬰幼兒配方乳粉，鋁箔紙密封袋包裝，河北省食品檢驗研究院）。

1.2 試劑耗材

生物素檢測國標即用型套裝（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；硫酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；實驗室用水均為無菌水。

1.3 儀器與設(shè)備

INE 500型恒溫培養(yǎng)箱（德國Memmert公司）；Cary 60型紫外可見分光光度計（美國安捷倫公司）；ME 203型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；PB-21型PH計（德國賽多利斯公司）；HVA-85型高壓滅菌鍋（日本HIRAYAMA公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品處理

按照GB 5009.259—2016[7]中6.2.2的要求對2份樣品進行相應(yīng)處理，并進一步稀釋。

1.4.2 培養(yǎng)基和標準溶液制備（無菌操作）

按照生物素檢測國標即用型套裝試劑盒說明書進行培養(yǎng)基、生物素標準溶液和生物素標準工作液的制備。

1.4.3 標準系列管制備

取無菌試管按表1順序加入各成分，制作標準曲線管，1式3份。

表1 標準系列管制作 單位：mL

1.4.4 試樣系列管制備

將制備好的樣品稀釋液使用無菌濾膜（0.22 μm）過濾，按GB 5009.259—2016[7]中6.4.1的要求加入無菌水、無菌樣品溶液和生物素培養(yǎng)基于無菌試管中，混勻。每個梯度做3個平行。

1.4.5 培養(yǎng)

于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)44～48 h至獲得最大渾濁度。

1.4.6 測定

將培養(yǎng)好的標準系列管、試樣系列管渦旋混勻，使用紫外可見分光光度計于波長550 nm處測定標準系列管、試樣系列管吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

采用Excel以標準系列生物素含量與吸光度進行線性回歸分析，得到線性擬合曲線，如圖1所示。線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.990 1，生物素標準曲線線性關(guān)系良好。

圖1 生物素標準曲線

2.2 結(jié)果計算

按GB 5009.259—2016[7]中6.7.2的要求進行結(jié)果計算，具體結(jié)果見表2，精密度分別為0.40%和0.73%，結(jié)果有效。綜合結(jié)果進行上報，樣品NLYZ-YP-058生物素含量為22.4 μg/100 g，樣品NLYZ-YP-109生物素含量為34.1 μg/100 g。結(jié)果反饋Z值分別為0.30和0.52，均小于2.0，結(jié)果評價均為滿意，表明該項目實驗室檢測能力無偏倚。

表2 樣品測定結(jié)果

3 分析與討論

生物素的檢測方法眾多，主要有微生物法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、生物傳感器法、熒光免疫層析法等，但每一種檢測方法各具優(yōu)缺點，各有其適用范圍[8-15]。其中，微生物法測定的生物素是有生物活性的，反映食品中能被人體吸收利用的生物素含量，并且具有靈敏度高、檢測限低、可靠性強、成本較低、適用范圍廣等優(yōu)點[8]。但該法檢測生物素前處理復(fù)雜，操作步驟繁瑣，對試驗器皿和試驗人員操作技術(shù)要求較高，且耗時較長，要確保檢測數(shù)據(jù)準確可從幾方面進行分析，并及時改進[2,16-17]。

3.1 人員

在微生物試驗中，檢測人員的檢測技能、關(guān)鍵點掌握、操作熟練度等都對檢測結(jié)果準確性有重要影響，因此，檢測人員必須具有夯實的業(yè)務(wù)能力、熟練的操作技術(shù)，實事求是、嚴謹認真的工作態(tài)度，能正確理解標準，規(guī)范實施檢測[18]。GB 5009.259—2016方法對于很多細節(jié)有很高的要求，這就要求檢測人員有一定的檢測經(jīng)驗積累。因此，在能力驗證時，主檢人員要責(zé)任心強、操作經(jīng)驗豐富、分析和解決問題能力強[19]。

3.2 玻璃器皿處理

在測定過程中，生物素易與抗生素因子結(jié)合，污染概率高于泛酸等其他維生素，且油脂會促進植物乳桿菌的生長[17,20]。因此，生物素檢測試驗所有用品要專用，不與其他試驗混合使用，此外，試驗過程中用到的所有玻璃器皿要嚴格處理，使用前用一定濃度鹽酸漂洗，用蒸餾水清洗干凈后170 ℃烘烤3 h，從而去除殘留的微量生長因子。同時，嚴格清理檢測場所，確保無菌潔凈[17,20-21]。

3.3 菌株制備

試驗菌株是維生素試驗的關(guān)鍵，因此，必須嚴格控制菌種的保存和轉(zhuǎn)種，使用前連續(xù)傳代3次以增強菌種活力，提高菌種對生物素的敏感性。此外，有研究表明，利用甘油在超低溫條件下凍存處于對數(shù)期生長的測試菌種，取出后可直接用于測定中，菌種活性強，測定效果較好，大幅提高實際工作中試驗的效率[22-23]。在能力驗證中所使用的檢測菌株是試劑盒自帶的凍干菌球，取得較好的試驗結(jié)果，因此，各實驗室可根據(jù)實際需要選擇合適的菌株制備方法。

3.4 試樣制備

試樣前處理是影響測定結(jié)果準確性的另一關(guān)鍵因素，所以應(yīng)嚴格按照標準要求進行試樣前處理。GB 5009.259—2016對嬰幼兒配方食品中生物素采用3%（約0.5 mol/L）硫酸進行提取，且隨著硫酸溶液濃度的提高，生物素的含量會下降[24-25]。試樣水解后降溫過程要迅速，避免發(fā)生顏色變化。試樣稀釋后的生物素濃度（一般通過樣品標簽標示值獲得）應(yīng)盡量被標準溶液的系列梯度所覆蓋，必要時可多選幾個稀釋度[21]。同時試樣處理時，需要用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，需注意如果調(diào)過頭，用H2SO4調(diào)回，不能用HCl，因為HCl會使生物素失去活性[20]。

3.5 標準系列管制備

為避免交叉污染，在制備標準系列管時要使用專用的器皿，同時建議按照添加水—培養(yǎng)基—蓋上空白管的試管帽—標液和樣品稀釋液的順序進行操作，標準品、樣品檢測3次[21]。

3.6 培養(yǎng)和測定

所有試管均避光培養(yǎng)直至獲得最大渾濁度，混勻后測定吸光度。國標檢測都采用紫外分光光度計來測定培養(yǎng)物的吸光度，為保證儀器設(shè)備工作狀態(tài)良好，應(yīng)按照國家相關(guān)法律法規(guī)的要求對儀器進行檢定、校準或期間核查，并定期進行維護和性能驗證，做好相關(guān)記錄，以減小儀器帶來的誤差并方便溯源，若儀器設(shè)備被檢修，恢復(fù)使用前應(yīng)對其進行檢查或校準，以保證性能符合檢測要求。

3.7 結(jié)果分析

在標準曲線擬合過程中，各個點并不是嚴格分布在直線上，這是因為微生物生長過程中會受到競爭與抑制作用，隨著生物素濃度的增加，吸光度增長趨緩，所以，通常情況下標準曲線相關(guān)系數(shù)大于0.95就可以接受[21]。

4 結(jié)論

能力驗證采用國標方法對嬰幼兒配方乳粉中的生物素進行測定，取得滿意結(jié)果，這離不開實驗室檢測人員仔細閱讀作業(yè)指導(dǎo)書、規(guī)范操作、對試劑等做好質(zhì)控等。通過能力驗證，實驗室檢測能力、人員專業(yè)技術(shù)能力、職業(yè)素養(yǎng)等都有了很大提升。

能力驗證不僅可以客觀地衡量實驗室檢測能力和管理水平，也是實驗室內(nèi)外部質(zhì)控的有效手段。實驗室通過參加能力驗證活動，可以全面了解實驗室的檢測能力，還可以及時發(fā)現(xiàn)存在問題，也為后期開展食品檢驗檢測工作實施提供對照依據(jù)和新思路。