CD4+CD25+Treg細胞與腫瘤免疫研究進展

王 彩綜述 魏素菊審校

機體免疫系統通過免疫監視功能，識別和清除包括腫瘤、微生物等“非己”成分，維持機體的穩定。惡性腫瘤在機體內往往表現出免疫逃逸的特殊狀態，與機體抗腫瘤的免疫效應之間形成一對此消彼長的矛盾關系。近些年研究發現，CD4+CD25+調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)可通過抑制激活的 T 細胞功能，影響機體抗腫瘤免疫作用，在維持自身免疫耐受性中發揮著重要作用，與腫瘤免疫逃逸關系密切[1]。機體的細胞免疫受抑是腫瘤發生、發展、轉移和復發的重要原因。許多腫瘤患者的外周血和腫瘤組織中的Treg細胞比例升高，往往提示著預后不良[2]。因此，近年來通過調節CD4+CD25+Treg 細胞的數量或功能來增強機體抗腫瘤免疫成為腫瘤免疫治療的焦點。本文就CD4+CD25+Treg細胞的生物學特征、免疫抑制機制及其在腫瘤免疫中的作用作一綜述。

1 CD4+CD25+Treg細胞概述

1.1 CD4+CD25+Treg細胞的分類及分子標志

1995年，Sakaguchi等首次報道在人和小鼠的外周血中有 5%～10%的CD4+T 細胞持續高表達 CD25分子，去除這群T細胞的裸鼠會發生多種自身免疫性疾病，而將去除的細胞群重新回輸，則可預防疾病的發生。這一現象提示CD4+CD25+T細胞有可能是維持自身免疫耐受的重要因素，對免疫功能具有調節作用,隨之產生了調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)的概念。此后，該類細胞逐漸成為免疫學研究領域的熱點。目前認為Treg細胞是1個異質性群體，根據其來源和效應機制分為兩類：天然型CD4+CD25+Foxp3+Treg(nTreg)和誘導性Treg(iTreg)[3]。nTreg在胸腺中產生，成熟后遷移至外周淋巴系統。它占外周血CD4+細胞的5%～10%，表達IL-2 受體的α 鏈(即CD25)，主要通過與效應細胞之間的直接接觸介導免疫抑制作用，從而維持機體免疫耐受及抑制自身免疫性疾病。iTreg細胞主要由外周成熟的CD4+T細胞在特定的抗原和(或)IL-2、TGF-β 等細胞因子的誘導下轉化為具有Treg 細胞功能特征的細胞群。iTreg可分為Tr1(CD4+CD25+/-Foxp3-IL-10highregulary1 T cells)和Th3(CD4+CD25+/-Foxp3-TGF-βhighhelper3 T cells)2種亞群，分別主要通過分泌IL-10和TGF-β等細胞因子介導免疫抑制功能。除上述兩大類Treg細胞外，CD8+CD28-Treg、CD3+CD4-CD8-Treg和外周血天然殺傷 T 細胞等[4]其他一些Treg 細胞也逐漸被人們所認知。

CD4+CD25+Treg細胞可表達多種分子，如抑制性共刺激分子 CTLA-4、腫瘤壞死因子受體超家族成員GITR、Toll 樣受體4、趨化因子受體CCR4、程序性死亡受體1、淋巴細胞抗原復合體6等。其中某些分子曾作為Treg細胞的常用標記，但由于它們同時也表達于活化的效應性淋巴細胞表面,因此這些分子的表達缺乏特異性。

叉頭樣轉錄因子家族成員Foxp3是目前人CD4+CD25+Treg細胞比較特異的形態和功能性指標，在Treg細胞的發育、分化和成熟以及功能維持方面起著重要作用，被認為是CD4+CD25+Treg細胞的最敏感標記[5]。Foxp3在Treg細胞的組成性表達是該細胞亞群發揮功能的前提。人類同源基因 Foxp3的突變可引起X染色體性聯綜合征。然而，Foxp3是細胞核產物，不在細胞表面表達，因此不能直接單獨作為Treg細胞的選擇性標記。

大多數人類CD4+T 細胞可表達 CD127分子(IL-7受體的一條鏈)。研究顯示，CD4+CD25+Treg細胞低表達 CD127分子，并且CD127 與 Foxp3 的表達呈負相關。聯合應用CD25 和 CD127可得到高純度的 Treg 細胞。另有研究發現CD49d與Foxp3的表達也呈負相關，CD49d與CD127 聯合檢測有助于得到高純度的Treg 細胞。

1.2 CD4+CD25+Treg細胞的免疫功能特性

CD4+CD25+Treg細胞具有免疫無能性和免疫抑制性兩大功能特征。前者表現為對IL-2單獨刺激或CD3單抗和CD28單抗聯合作用呈低反應狀態，也不分泌IL-2，但在高濃度IL-2或抗CD28單抗刺激下并經T 細胞受體(TCR)介導信號，CD4+CD25+Treg細胞可活化并增殖；后者表現在經TCR介導的信號刺激活化后能抑制CD4+和CD8+T細胞和B細胞的活化和增殖，并且這種免疫抑制性不具有MHC限制性，即為非抗原特異性，能夠抑制同種同型或同種異型T細胞的增殖。

2 CD4+CD25+Treg細胞介導的免疫抑制機制

Treg細胞對效應性T細胞的抑制作用可以通過細胞接觸和分泌細胞因子方式實現。隨著對參與Treg細胞免疫調節活動的效應分子研究的逐步深入，依據分子特性及功能的不同，可將 Treg細胞介導的免疫抑制機制概括為4種基本途徑。

2.1 依賴抑制性細胞因子的途徑

nTreg細胞分泌多種免疫抑制性細胞因子，其中轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和IL-10被認為是介導Treg細胞免疫抑制的關鍵因子。TGF-β 對機體多種免疫細胞的生長、分化具有重要的調節作用。它可抑制IL-1和IL-2的分泌，進而抑制T細胞增殖。Frimpong-Boateng 等[6]發現，Treg 細胞可通過分泌 TGF-β 抑制NK細胞的殺傷功能。此外，TGF-β可抑制巨噬細胞和樹突狀細胞表達共刺激分子[7]，從而抑制抗腫瘤免疫反應。IL-10可以抑制單核細胞、NK細胞的活化及Th1細胞合成IL-2等細胞因子，抑制DC和巨噬細胞 MHC-Ⅱ類分子的表達及降低抗原提呈作用，從而起到免疫抑制的功能。Miriam 等[8]證實黑色素瘤組織中的IL-10能降低特異性細胞毒性淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)的靈敏性，并抑制瘤抗原提呈。此外，Treg細胞可高表達CD25(IL-2受體的α鏈)，競爭性結合T細胞增殖的關鍵因子IL-2，從而抑制效應T細胞增殖分化。同時Treg 細胞結合 IL-2后又可促進自身增殖分化，進一步增強對效應 T 細胞的免疫抑制作用[9]。纖維蛋白原樣蛋白2(fibrinogenfi-like protein 2，FGL2)是Treg細胞的另一種重要的抑制因子，可通過FcγRⅡb受體介導免疫抑制效應，被認為是Treg細胞發揮功能的標記[10]。靶向去除小鼠中的FGL2，會導致DC、T、B細胞的免疫反應增強和自免性腎病的發生。

2.2 破壞細胞代謝的途徑

Treg細胞可破壞效應靶細胞的穩態、代謝途徑及信號傳導通路，繼而抑制其免疫反應。第二信使cAMP則參與了該過程。Treg細胞通過縫隙連接將cAMP直接導入靶細胞，通過消耗 IL-2誘導靶細胞凋亡。Treg細胞也可通過增強腺苷酸依賴的信號傳導，間接提高靶細胞內cAMP水平。此外，Treg可通過CD39和CD73水解ATP酶，提高細胞微環境中腺苷酸水平，進而活化效應細胞上腺苷酸受體A2A，產生免疫抑制作用[11]。腺嘌呤二核苷酸(NAD)可影響Treg細胞表型和功能，它可通過細胞溶解或非溶解的方式釋放入胞外，通過ADP糖基化活化P2X7受體，繼而介導T細胞死亡。

2.3 溶解細胞的途徑

Treg細胞可通過釋放顆粒酶A/B、穿孔素或通過TRAIL-DR5(腫瘤壞死因子相關細胞凋亡誘導配體-死亡受體-5)途徑直接殺傷效應細胞，起到免疫抑制作用。人源CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞在抗CD3和CD46抗體共同作用下活化,可誘導表達顆粒酶 A(granzyme A)，通過穿孔素依賴機制去除活化的 CD4+和CD8+T細胞，CD14+單核細胞和成熟及未成熟的DC。此外，靶細胞可通過過表達顆粒酶特異性抑制劑，抵抗細胞死亡。Suzan等[12]發現在體外試驗中，去除顆粒酶B的Treg細胞對CD8+T細胞擴增的抑制作用減弱。人源和鼠源Treg細胞可高表達溶細胞半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-1表達不足的鼠源Treg細胞在體外試驗中顯示免疫抑制功能受損。

2.4 調節抗原遞呈細胞(APC)功能的途徑

Treg細胞介導的免疫抑制還可通過調節抗原遞呈細胞的功能間接實現，其中某些抑制性膜相關分子在該途徑中發揮重要作用。最具代表性的就是細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)，它也是Treg 表達的重要分子標記，可與DC表面的CD80和CD86共同作用，誘導抗原遞呈細胞(DC為主)產生吲哚-2，3-加雙氧酶(IDO)，該酶可降解細胞代謝必需的色氨酸，色氨酸缺失會抑制 T 細胞活化，從而導致T細胞凋亡。此外，CTLA-4還可通過與B細胞、T細胞、DC和巨噬細胞上的配體B-7結合，抑制靶細胞的活化與增殖。Wing 等研究發現，CTLA-4 誘導缺陷的荷瘤小鼠可發生全身性淋巴細胞增殖，產生顯著的抗腫瘤免疫反應，引起腫瘤消退。

有研究發現另一種膜相關抑制因子，即淋巴細胞活化基因-3(lymphocyte activationgene-3，LAG-3/CD233)。它是表達于Treg細胞上的跨膜蛋白，也是CD4分子相關黏附蛋白，可與抗原遞呈細胞的MHCⅡ結合。當Treg和DC相互作用時，LAG-3與MHCⅡ結合后會誘導免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM)介導的抑制信號通路，產生負向信號，繼而抑制DC成熟，下調其免疫激活的能力。體內外試驗均顯示應用LAG-3抗體可阻斷Treg細胞抑制功能。然而LAG-3缺失小鼠未發生自免性疾病。

3 CD4+CD25+Treg細胞在腫瘤微環境中的分布及意義

CD4+CD25+Treg細胞以其獨特的免疫抑制作用，影響機體抗腫瘤免疫，在腫瘤免疫逃逸中發揮重要作用，并進一步影響腫瘤的轉歸和預后。很多證據表明在肺癌、乳腺癌、宮頸癌及腎癌等不同惡性腫瘤患者的外周血、腫瘤局部及腫瘤浸潤淋巴結中，CD4+CD25+Treg細胞比例增高，并顯示出與疾病進程及預后呈負相關。Shah等[13]證實腫瘤局部浸潤CD4+Fox3+Treg細胞比例較高的宮頸鱗癌患者，其5年生存率顯著降低。Shen等[14]發現胃癌患者中，瘤內Fox3+Treg細胞比例增高者的總生存期相對縮短。Mahmoud等[15]報道乳腺癌患者外周血及癌組織中可檢測到Treg細胞比例增高。同時，單因素分析顯示瘤內及癌旁基質中Fox3+Treg細胞數目與乳腺癌患者的預后呈負相關。Bachy等[16]發現慢性粒細胞白血病(CML)患者外周血Treg細胞水平升高，化療后未完全緩解組Treg細胞水平比完全緩解組高。Lin等[17]報道瘤內Foxp3+Treg細胞比例與肝細胞癌患者的預后呈負相關。Liotta等[18]研究證實在腎細胞癌患者的腫瘤浸潤淋巴結和外周血中Treg細胞數均上升，且前者升高顯著，并與預后不良相關。Kang等[19]進一步發現對于腎透明細胞癌患者，腫瘤浸潤淋巴結中增高的Treg細胞可作為總生存率的獨立預測指標之一，并與增高的遠處轉移率和降低的無復發生存率密切相關。Shimizu等[20]報道腫瘤浸潤Foxp3+Treg細胞數目與淋巴結陰性非小細胞肺癌患者的無復發生存率呈負相關。上述眾多研究結果表明Treg細胞在多種實體瘤和血液系統惡性腫瘤的微環境中普遍增高，并且與腫瘤轉歸及預后有密切關系。

腫瘤微環境中CD4+CD25+Treg細胞積聚的具體機制仍不明確，可能與以下因素有關：①腫瘤細胞可通過分泌IL-10、IL-2和TGF-β等因子誘導CD4+CD25+Treg細胞擴增，并誘導CD4+CD25-Treg向CD4+CD25+Treg細胞轉化；②腫瘤細胞分泌的CCL22可與CD4+CD25+Treg細胞表達的CCR4(趨化因子CCL22受體)相結合，繼而使Treg細胞在腫瘤局部富集；③抗原遞呈細胞可通過腫瘤相關抗原進一步擴增CD4+CD25+Treg 細胞；④在由Fas-Fasl介導的凋亡中，CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T細胞存在敏感性上的差異，腫瘤通過分泌細胞因子選擇性地誘導 CD4+CD25-T細胞凋亡[21]。

腫瘤微環境在腫瘤發生發展中的重要作用已被廣泛認可。然而與上述研究結果有所不同的是，腫瘤局部積聚Foxp3+Treg細胞，并非總與預后不良相關。某些腫瘤，尤其是結直腸癌，局部Foxp3+Tregs的比例與預后呈正相關。Salama等發現腫瘤浸潤組織中Foxp3+Treg細胞比例較高的結直腸癌患者，其生存期相對延長。這一發現已被Frey等[22]證實。Bron等[23]報道在口咽癌、口腔鱗癌患者和淋巴結未轉移的頭頸部鱗癌患者中，腫瘤浸潤Foxp3+Treg細胞普遍增多，并與延長的總生存期相關。Lee等[24]研究發現三陰性乳腺癌患者的腫瘤局部積聚的Foxp3+Treg細胞與其延長的生存期密切相關。在典型的霍奇金淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤中高水平的Treg細胞可改善患者生存率[25]。對于這些研究結果，不排除某些腫瘤的預后可能更多的是與激活的CD4+或CD8+T細胞相關，并非僅是Foxp3+Treg細胞。然而，現有研究尚未能對此做出合理解釋。目前多數學者認為Treg細胞能抑制機體抗腫瘤免疫，促進腫瘤發展。腫瘤微環境中Treg水平的升高往往提示預后不良。

4 CD4+CD25+Treg細胞與腫瘤免疫治療

腫瘤的免疫治療已成為繼手術、放射治療和化學治療之后又一種重要的治療手段。最近的研究[26]表明Treg細胞在腫瘤治療中的作用是復雜多樣的。盡管如此，體內清除Treg細胞可提高機體抗腫瘤免疫能力，這一觀點被普遍接受。眾所周知，低劑量的環磷酰胺具有免疫調節特性，大量的腫瘤動物模型實驗顯示，應用環磷酰胺去除Treg細胞，可促進效應性T細胞功能的恢復。但有研究證實此法對腫瘤患者的免疫治療效果欠佳。目前去除Treg細胞的方法包括抗CD25單克隆抗體、咪喹莫特、弗達拉濱、抗-CTLA-4 單克隆抗體、Toll 樣受體配體等。Pedroza-Gonzalez等[27]研究表明對于原發性肝癌或結直腸癌肝轉移癌患者，應用可溶性GITR配體(GITRL)能在一定程度上阻礙腫瘤浸潤Treg細胞的免疫抑制功能。由于CD25、CTLA-4等并非Treg 細胞所特有，因此，去除Treg細胞聯合其他免疫治療(如瘤苗、化療藥物、過繼性輸入TIL細胞等)也許是最佳的臨床選擇。Rech等[28]證實聯合應用抗CD25單抗和瘤苗可顯著、持久地降低轉移性乳腺癌患者體內的Treg細胞數目。Duraiswamy等[29]研究顯示靶向抑制PD-1/PD-L1信號通路可在增強效應性T細胞功能的同時，抑制Treg細胞功能，并提出聯合應用抗PD-1、抗CTLA-4抗體及瘤苗可有效抑制腫瘤，但需進一步的臨床試驗證實。抗CTLA-4抗體Ipilimumab已于2011年先后被FDA、歐盟委員會批準用于黑色素瘤患者的治療。PD-1、PD-L1阻斷抗體已進入Ⅲ期臨床試驗。

然而，由于Treg細胞在腫瘤治療中的作用并非完全明了，Treg細胞的清除也許是把雙刃劍。一項研究[30]顯示，對于未接受過化療的結腸癌患者，腫瘤微環境高表達Foxp3+Treg細胞組比低表達組在總生存期及無疾病進展生存期方面，具有顯著優勢。因此，在抗腫瘤免疫治療中，是選擇清除還是擴增Treg細胞則尤為重要，相關的臨床實驗在進一步研究中。

總之，腫瘤的發生發展與機體的免疫功能密切相關。Treg細胞可能控制著效應性細胞的活化和增殖，具有抑制免疫應答的作用，與腫瘤免疫逃逸關系密切。有關腫瘤微環境中Treg細胞的水平對腫瘤發生、發展、復發及預后影響的報道不一，其具體作用機制有待于進一步研究。目前去除Treg細胞是抗腫瘤免疫治療的主要手段，進一步探索Treg細胞對腫瘤免疫功能影響的細胞及分子作用機制，將可能為臨床治療提供新的思路。

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