雞傳染性法氏囊病毒常用檢測(cè)技術(shù)概述

趙青梅 （山西省平遙縣畜牧中心 031100）

雞傳染性法氏囊病毒常用檢測(cè)技術(shù)概述

趙青梅 （山西省平遙縣畜牧中心 031100）

雞傳染性法氏囊病(IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一種主要危害雛雞的免疫抑制性傳染病。本病發(fā)病率高，發(fā)生本病的雞場(chǎng)，常常出現(xiàn)新城疫、馬立克氏病等疫苗接種的免疫失敗，這種免疫抑制現(xiàn)象常使發(fā)病率和死亡率急劇上升。因此快速準(zhǔn)確地檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)，對(duì)正確診斷、預(yù)防雞傳染性法氏囊病，降低養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失十分重要。本文將就雞傳染性法氏囊病病毒常用的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行分類介紹。

1 雞傳染性法氏囊病毒分離

取病雞的法氏囊或脾臟，研碎后加入滅菌生理鹽水，制成混懸液，離心取上清液，加適量雙抗，通過絨毛尿囊膜途徑接種9～11日齡SPF雞胚。3～5d后雞胚出現(xiàn)死亡，胚體充血、出血、肝臟有斑點(diǎn)狀壞死和出血斑。取絨毛尿囊膜或尿囊液與雞傳染性法氏囊病陽性血清進(jìn)行中和試驗(yàn)鑒定，或在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳至第4代，接種后第5天出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變。

2 電子顯微鏡直接檢查雞傳染性法氏囊病病毒

取病死雞法氏囊用4%戊二醛和1%鋨酸雙固定后，再按常規(guī)乙醉系列脫水，環(huán)氧丙烷過濾，618或812樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和棕檬酸鉛染色做常規(guī)電鏡標(biāo)本，電子顯微鏡下觀察，可見晶格狀排列、近似六角形、二十面體立體對(duì)稱的IBDV。

3 血清學(xué)方法

3.1 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP) 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)主要用于檢測(cè)血清中的抗體或抗原。取病死雞的法氏囊或肝臟，研磨制備成混懸液，與IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行AGP。

3.2 免疫熒光檢測(cè)技術(shù) 熒光抗體染色技術(shù)(FAT)是基于抗原抗體反應(yīng)原理，將熒光染料如FITC標(biāo)記到特異性抗體上，熒光抗體與病料中病毒或分離的病毒反應(yīng)，通過熒光顯微鏡觀察做出判斷[1]，分為直接免疫熒光和間接免疫熒光，常用作初次診斷。

3.3 免疫電泳檢測(cè)技術(shù) （1）對(duì)流免疫電泳技術(shù)(CIET)，是一種在免疫雙擴(kuò)散的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種加速了免疫擴(kuò)散的檢測(cè)技術(shù)，其靈敏、漸變準(zhǔn)確迅速。（2）火箭免疫電泳技術(shù)(RIEP)，是一種在電場(chǎng)力的作用下，使得抗原通過含有抗體的瓊脂凝膠時(shí)，與相應(yīng)的抗體形成抗原抗體復(fù)合物，并在兩者比例適當(dāng)部位沉淀下來的檢測(cè)技術(shù)。

4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是將抗原或抗體吸附到固相載體上利用標(biāo)記酶反應(yīng)測(cè)定抗體或抗原含量的一種檢測(cè)方法，該方法敏感特異、操作簡(jiǎn)便、易于重復(fù)，是目前最常用的一種免疫檢測(cè)方法。吳紅專等標(biāo)記單抗M22制備了單抗ELISA試劑盒，大量臨床樣本的檢測(cè)表明該試劑盒檢測(cè)準(zhǔn)確性與病毒分離鑒定結(jié)果基本一致。1981年Howie首次應(yīng)用ELISA進(jìn)行IBDV的檢測(cè)，此法是檢測(cè)IBDV的特異、敏感、快速和重復(fù)性好的一種方法。Marquardt等和劉源遠(yuǎn)建立了間接ELISA定量檢測(cè)IBDV抗體。剛松堂等[2]建立了雙抗體夾心法，此法靈敏度是AGP 的200倍。黃金海等[3]建立了免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)( IPMA) 來檢測(cè)雞血清中IBDV抗體。伊嵐等[4]建立了斑點(diǎn)—酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Dot-EL ISA) 檢測(cè)雞血清中IBDV 抗體，檢出的陽性率為100%，具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、重復(fù)性好、直觀性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于IBDV母源抗體及雞群接種疫苗后特異性抗體的檢測(cè)。

5 單抗技術(shù)

Snyder等[5]最先對(duì)用單抗技術(shù)檢測(cè)IBDV抗原進(jìn)行系統(tǒng)研究，證明單抗技術(shù)不僅具有常規(guī)ELISA方法的各種優(yōu)點(diǎn)，而且能夠利用中和單抗區(qū)分不同的血清型和亞型。日本學(xué)者Nakamura等[6]利用聚苯乙烯微球聯(lián)接單抗對(duì)IBDV抗原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果更敏感、快速，室溫下用玻片作凝集反應(yīng)，5min便出結(jié)果，既可定性又可定量。Snyder等[7]還利用中和單抗免疫酶組化法直接檢測(cè)到組織中IBDV的抗原漂移，并鑒別出了群特異性和型特異性中和位點(diǎn)。另外，Mundt等[8]利用單抗技術(shù)與其它方法相結(jié)合還從IBDV感染細(xì)胞中鑒定出該病毒的一種新蛋白成分VP5。T ure等[9]也利用單抗Do t-ELISA對(duì)不同毒株IBDV抗原檢測(cè)進(jìn)行了詳細(xì)研究，并指出非中和性單抗可以和IBDV的各個(gè)毒株發(fā)生反應(yīng)，而中和性單抗卻不具備這一點(diǎn)，因此從抗原檢測(cè)的角度看，前者更優(yōu)于后者。王成明等[10]用其建立的中和單抗作雙夾心ELISA對(duì)病雞囊中IBDV的檢出率為100%。劉濱東等[10]報(bào)道，他們建立的8株針對(duì)vp2的單抗中，有4株具有良好的診斷和治療作用。陶素華等[11]報(bào)道，他們利用堿性磷酸酶-抗酶橋聯(lián)酶標(biāo)顯色技術(shù)(APAAP)聯(lián)接單抗對(duì)感染細(xì)胞的IBDV進(jìn)行檢測(cè)獲得滿意結(jié)果。隨后又用同位素標(biāo)記單抗對(duì)來源于6個(gè)省市的7株IBDV進(jìn)行了抗原表位變化的測(cè)定[12]。

6 病毒中和實(shí)驗(yàn)

病毒與特異性血清作用后失活或部分失活，從而喪失或降低其對(duì)易感細(xì)胞的感染性，結(jié)合病理觀察或熒光染色技術(shù)等作出診斷。

7 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

7.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù) PAGE技術(shù)是研究蛋白質(zhì)的一種重要方法，它主要是利用蛋白質(zhì)分子量的差異將不同的蛋白質(zhì)在電泳介質(zhì)中區(qū)分開，通過染色對(duì)目的蛋白作出鑒定。在IBD 的診斷中，此法不僅可檢出病毒特異性蛋白，而且可以區(qū)分出毒株間的差異。

7.2 蛋白質(zhì)印漬(Westernblot)技術(shù) Westernblot是將PAGE與抗體標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來對(duì)特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的一種先進(jìn)方法。它不僅可能測(cè)得病毒蛋白的種類、分子量等特性，而且還可借助特異性抗體或單抗對(duì)病毒蛋白的免疫學(xué)特性進(jìn)行研究。Fachey等[13]首先用此法對(duì)IBDV 的免疫原性進(jìn)行了鑒定。

7.3 核酸探針技術(shù) 核酸探針技術(shù)也叫核酸雜交技術(shù)，該技術(shù)是在特異性核酸片段上標(biāo)記放射性同位素或生物素制備探針，利用分子雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的一種診斷方法。是80年代發(fā)展起來的一種新的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，90年代用于診斷IBDV。這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，靈敏度高，尤其適用于IBDV的早期診斷。

7.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)具有高度靈敏、特異、快速等特點(diǎn)，能從僅含1個(gè)拷貝的樣品中檢出目的核酸，而且對(duì)被檢樣品預(yù)處理要求不高，因此特別適合于含毒量極少的感染組織診斷，包括早期感染的診斷。Davis等[14]最早將PCR技術(shù)應(yīng)用于IBD的診斷，用PCR技術(shù)從未經(jīng)純化的污染囊和糞便中直接檢出了IBDV。王永山等于1994年就正式報(bào)道了用反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)檢測(cè)IBDV的方法，可以檢出10fg的病毒RNA。

7.5 熒光定量PCR技術(shù) 熒光定量PCR(Fluorescent quantitative PCR)，是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。此定量方法的應(yīng)用基礎(chǔ)是Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性及雙標(biāo)記熒光探針的發(fā)現(xiàn)，它融合了PCR及DNA探針雜交優(yōu)點(diǎn)，能直接檢測(cè)PCR擴(kuò)增過程中信號(hào)的變化，可對(duì)核酸進(jìn)行相對(duì)及絕對(duì)定量。在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺(tái)期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來檢測(cè)PCR產(chǎn)物量，并且由此來推斷模板最初含量。目前常用的TaqMan探針法相比較SYBR Green Ⅰ染料法更為特異準(zhǔn)確。

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