CTGF在食管癌組織中表達及其促進凋亡抵抗的作用機制

黃 芳

結締組織生長因子(CTGF)是CCN家族成員之一[1]。CTGF是一個富含有半胱氨的分泌蛋白，與細胞表面及細胞外基質有關，并且可以與多個整合素相互作用[2-3]。最近的研究表明，CTGF在多種腫瘤的發生和發展過程中也起著重要作用[4-5]。本研究應用pcDNA3.1CTGF過表達載體及siRNA干擾方法，轉染人食管癌Eca109細胞，分別增加細胞CTGF的表達及抑制內源的CTGF的表達，并用INF-γ處理，觀察其對Eca109細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

30例食管癌標本取自2009年無錫市第一人民醫院胸外科，所有病例均病理檢查證實，取癌旁組織為正常對照。培養食管癌細胞系Eca109使用RPMI 1640培養基，其含有10%FBS，在37℃，5% CO2的培養條件下培養。

1.2 CTGF過表達質粒構建及小RNA(siRNA)干擾

通過RT-PCR獲得編碼CTGF全長的cDNA。PCR產物用含有1%EB的瓊脂糖凝膠進行分離，在紫外線下進行切膠純化。在構建Eca109穩定的細胞株時，應用Lipofectamin的轉染試劑將CTGF表達載體和對照載體轉染Eca109，并嚴格按照試劑盒說明書進行操作。最后用600 μg/μl的G418篩選2周，得到克隆后采用Western Blot進行鑒定。

1.3 RNA制備及Real-Time PCR分析

組織標本及細胞的RNA采用前述方法進行制備。用于Real -Time PCR檢測的CTGF引物。并以β-actin作為內參，進行PCR擴增反應。本研究所有的反應均為一式三份，并在iCycler iQ system(Bio-Red)上進行反應。所有引物的擴增產物均要進行溶解曲線和DNA凝膠電泳分析。

1.4 免疫組織化學染色

免疫組織化學染色采用Envision兩步法進行。食管癌標本和癌旁組織用中性福爾馬林液固定，并進行石蠟包埋，包埋后5 μm連續切片，并嚴格按Envision兩步法試劑盒說明書進行操作。

1.5 Western Blot 分析

當細胞長至80%融合時進行細胞收集，并應用PBS清洗2次，之后應用RIPA Buffer于冰上裂解15 min，然后于4℃下離心細胞裂解液15 min，并用Bradford試劑測定存在的蛋白濃度，然后取等量的蛋白樣品加入6×SDS-PAGE樣品緩沖液，并煮沸5 min，變性后進行10%PAGE電泳，轉膜及顯色。其一抗是鼠抗CTGF單抗，二抗是由HRP標記的鼠抗IgG。

1.6 統計學分析

應用SPSS 16.0統計軟件進行統計學處理。實驗數據均以平均值±標準差的方式表示。采用單因素方差分析的方法進行各組間的比較，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 CTGF在食管癌的標本中表達情況

從15例患者的快速冷凍食管癌標本中提取RNA。與癌旁組織相比，CTGF mRNA在73.3%(22/30)食管癌的標本中表達上調。經單變量的統計分析結果顯示，兩組CTGF mRNA的表達水平存在差異，且差異具有統計學意義(P<0.05)。Western Blot檢測在配對的癌旁組織和癌組織中CTGF蛋白表達水平與Real-Time PCR檢測的CTGF mRNA表達水平一致。免疫組化染色結果顯示，癌旁組織中CTGF表達很弱，在腫瘤細胞胞質中呈強陽性表達。

2.2 過表達CTGF抑制食管癌細胞的凋亡

構建CTGF表達的食管癌Eca109細胞穩定株，并檢測了轉染穩定株中CTGF蛋白表達水平，并選擇了兩個不同表達水平的克隆，分別命名為Eca109/CTGF(H)和Eca109/CTGF(M)，對照組細胞命名為Eca109/C。在CTGF過表達的Eca109穩定菌株中，CTGF蛋白水平顯著高于對照組細胞水平。

應用IFN-γ(500 U/ml)處理細胞24 h后并檢測細胞凋亡情況。流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組的細胞凋亡情況相比，Eca109/CTGF(H)組和Eca109/CTGF(M)組細胞凋亡指數分別下降11.95%和4.22%。在IFN-γ處理后，Eca109/CTGF(H)組和Eca109/CTGF(M)組中Bcl-XL蛋白表達水平明顯高于對照組。

2.3 CTGF siRNA轉染細胞中CTGF表達水平

在CTGF siRNA轉染的Eca109細胞中，CTGF蛋白水平明顯低于對照組細胞(CTGF siRNA C)。流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組相比，CTGF siRNA組細胞凋亡指數明顯上升(10.16% vs 18.76%)。在IFN-γ處理后，CTGF siRNA組中Bcl-XL蛋白水平低于對照組。

3 討論

CTGF在創傷修復及纖維化疾病中起重要作用，但是CTGF在腫瘤的發展、演進[6-7]及腫瘤細胞的存活中也有重要作用[8]。本研究中我們發現，與癌旁組織相比，CTGF 在人食管癌的標本中高表達。

細胞凋亡不僅和腫瘤的發生、發展以及退化有著密切的聯系，而且是治療腫瘤的主要目標。本研究發現上調細胞中CTGF后，用INF-γ處理，可明顯增加其對INF-γ誘導的凋亡的抵抗性；下調CTGF后，其對INF-γ處理誘導的凋亡抗性明顯降低，提示CTGF可能是通過抑制凋亡增加藥物抵抗性。

為了探討CTGF增加細胞凋亡抗性的機制，我們研究了上調CTGF表達及下調CTGF表達，分別用INF-γ處理后，兩組細胞與其對照組細胞相比抗凋亡蛋白Bcl-XL蛋白表達情況。上調CTGF后，對于凋亡的抑制伴有Bcl-XL蛋白表達的增加；下調CTGF后，其對INF-γ誘導凋亡的抵抗性減弱同時伴有Bcl-XL的表達下調。CTGF表達增加和減少分別導致特異性的Bcl-XL蛋白表達的增加和降低，提示Bcl-XL在CTGF誘導的凋亡中起重要作用。

本研究結果顯示用IFN-γ(500 U/ml)處理細胞24 h后并且檢測細胞凋亡情況。流式細胞分析顯示，和Eca109/C組相比，Eca109/CTGF(H)組和Eca109/CTGF(M)組細胞凋亡指數明顯下降(11.95%vs 4.22%)。為了研究CTGF對于IFN-γ介導的凋亡對抗作用的機制，我們檢測了抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達水平變化。在IFN-γ處理后，Eca109/CTGF(H)和Eca109/CTGF(M)中，Bcl-XL蛋白表達水平明顯高于對照組。

本研究為了研究內源性的CTGF是否在食管癌細胞中凋亡抵抗起作用，我們用RNAi 介導的慢病毒載體下調Eca109中CTGF的基礎表達水平。為了檢測siRNA轉染是否有效的阻斷了內源的CTGF的表達，我們檢測了CTGF siRNA轉染細胞的CTGF的表達水平。在CTGF siRNA轉染的Eca109細胞中，CTGF蛋白水平明顯低于對照組細胞(CTGF siRNA C)。接下來我們研究干擾CTGF基礎表達對細胞凋亡抵抗的影響。用IFN-γ (500 U /ml)處理細胞24 h并且檢測細胞凋亡情況。流式細胞分析顯示，和CTGF siRNA C組相比，CTGF siRNA組細胞凋亡指數明顯上升。

本研究為了進一步檢測CTGF siRNA組凋亡指數的上升是否同樣與抗凋亡蛋白Bcl-XL相關，我們檢測了抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達水平變化。在IFN-γ處理后，CTGF siRNA組中，Bcl-XL蛋白水平低于對照組。Bcl-XL對傳統的抗腫瘤藥物的具有化療抵抗作用最先見于在表達Erb-B2的乳腺癌細胞中Bcl-XL表達上調，同時對三苯氧胺誘導的凋亡有抵抗性[9]。CTGF誘導Bcl-XL的上調與以前的研究結果一致：在乳腺癌中，CTGF的高表達與不良預后相關，并且增加了乳腺癌細胞的遷移[10]。

以上結果表明，CTGF可以顯著增強細胞的凋亡抵抗性，該作用與上調抗凋亡蛋白Bcl-XL有關。由于在標本及細胞中CTGF過表達與其對凋亡的調節作用一致，CTGF可以看做是食管癌化療敏感性中一個重要決定因素。因此，其可能是食管癌一個新的化療敏感性預測指標，并且可能是一個新的潛在治療靶點。

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