5-氨基酮戊酸光動(dòng)力學(xué)療法在體外對(duì)紅色毛癬菌的抑制作用研究

梁 義，盧麗明，陳 勇，尹 琦

（柳州市柳鐵中心醫(yī)院皮膚科，廣西 柳州 545007）

5-氨基酮戊酸光動(dòng)力學(xué)療法在體外對(duì)紅色毛癬菌的抑制作用研究

梁 義，盧麗明，陳 勇，尹 琦

（柳州市柳鐵中心醫(yī)院皮膚科，廣西 柳州 545007）

目的評(píng)估以5-氨基酮戊酸為光敏劑的光動(dòng)力療法在體外對(duì)紅色毛癬菌的抑制作用。方法以96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為實(shí)驗(yàn)載體，加入紅色毛癬菌懸液，分為治療組和4個(gè)對(duì)照組，其中治療組同時(shí)給予氦氖激光照射、加入5-氨基酮戊酸、共同避光孵育12 h等三個(gè)條件；而4個(gè)對(duì)照組均不紅色毛癬菌同時(shí)具備治療組所獲得的三個(gè)條件。然后按照設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行5-氨基酮戊酸光動(dòng)力學(xué)治療，并用噻唑藍(lán)法檢測(cè)紅色毛癬菌的存活率。結(jié)果5-氨基酮戊酸的濃度介于0.05%～2.5%之間時(shí)，治療組紅色毛癬菌的存活率依次遞減，對(duì)應(yīng)的存活率之間進(jìn)行兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，存活率對(duì)5-氨基酮戊酸的濃度呈劑量依賴關(guān)系。而當(dāng)5-氨基酮戊酸濃度介于2.5%～10%時(shí)，治療組紅色毛癬菌的存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，當(dāng)5-氨基酮戊酸的濃度介于0.05%～10%之間時(shí)，對(duì)照組中紅色毛癬菌的存活率未受影響，四組的紅色毛癬菌的存活率變化無(wú)明顯差異(P＞0.05)。結(jié)論在特定濃度下，5-氨基酮戊酸光動(dòng)力學(xué)療法對(duì)紅色毛癬菌有明顯的抑制作用。

5-氨基酮戊酸；光動(dòng)力療法；紅色毛癬菌；抑制

我國(guó)南方地區(qū)溫暖潮濕，特別適合各類致病性真菌的生長(zhǎng)，因此皮膚真菌感染成為該地區(qū)最為常見(jiàn)的皮膚感染之一。皮膚真菌感染如果未得到徹底治療，在特殊人群中(老年人和免疫力低下者)易發(fā)展為系統(tǒng)性真菌感染，帶來(lái)更嚴(yán)重的危害[1]。現(xiàn)有治療皮膚真菌感染的方法為口服或外用抗真菌藥物，但均對(duì)肝腎有一定的毒副作用，因此皮膚科領(lǐng)域急需一種簡(jiǎn)單易行，毒副作用更少的新療法。以5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acdi，5-ALA)為光敏劑的光動(dòng)力療法(Photodynamic therapy，PDT)是近年興起的一種新型治療方法，已被大量用于治療皮膚的各種良惡性腫瘤，如鱗狀細(xì)胞癌、光化性角化病和基底細(xì)胞癌，以及病毒疣等，同時(shí)5-ALA-PDT已被證實(shí)能夠殺滅真菌和細(xì)菌[2-4]。在各類致病性真菌之中，紅色毛癬菌是最重要和常見(jiàn)的病原菌之一。本實(shí)驗(yàn)將評(píng)估ALA-PDT在體外抑制或殺滅紅色毛癬菌的效果，為下一步將5-ALA-PDT用于治療由紅色毛癬菌感染所致的皮膚真菌感染提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑 紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由柳州市柳鐵中心醫(yī)院檢驗(yàn)科真菌室提供；5-氨基酮戊酸鹽酸鹽(ALA)由上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司提供。臨用前以二甲基亞砜(DMSO)配制成20%的ALA溶液備用。噻唑藍(lán)(MTT)、PBS緩沖液、RPMI1640液體培養(yǎng)基、沙堡氏培養(yǎng)基由Gibico公司提供。

1.2 主要儀器 HJZ-3型氦氖激光治療機(jī)，波長(zhǎng)為632.8 nm，輸出功率為37 mW，由成都國(guó)雄光電技術(shù)有限公司提供。

1.3 方法 參照梁義等[5]的方法進(jìn)行。

1.3.1 紅色毛癬菌懸液的制備 將紅色毛癬菌在新鮮配制的沙堡氏培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)種兩次，30℃培養(yǎng)，24 h后，取生長(zhǎng)良好的菌落5個(gè)，用滅菌生理鹽水制成懸液。通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整含菌量，使菌懸液含菌量為1×106CFU/ml(集落形成單位，Colony forming units)。需進(jìn)行MTT檢測(cè)時(shí)將菌懸液接種入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μl。

1.3.2 紅色毛癬菌的分組 將紅色毛癬菌分成：(1)治療組：往96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入不同量的ALA溶液，使每孔的ALA的終末濃度分別為10%、5%、2.5%、1.25%、1.0%、0.5%、0.25%、0.125%、0.05%。每個(gè)濃度的ALA分別加入12個(gè)培養(yǎng)孔，并于35℃避光孵育12 h。(2)4個(gè)對(duì)照組：a：?jiǎn)渭兊募t色毛癬菌懸浮液，無(wú)ALA-PDT處理；b：紅色毛癬菌懸浮液加入不同濃度的ALA共同孵育，無(wú)激光照射；c：紅色毛癬菌懸浮液未加入ALA，只予激光照射；d：紅色毛癬菌懸浮液加入不同濃度的ALA后立即予激光照射。每組12孔細(xì)胞，除d組外均于35℃避光孵育12 h。

1.3.3 氦氖激光照射 用光導(dǎo)纖維把激光引到培養(yǎng)孔上方，激光頭與培養(yǎng)板的垂直距離為0.5 cm，使光斑直徑為0.32 cm，剛好能覆蓋培養(yǎng)孔上口，照射的能量密度為55 J/cm2。按此方法對(duì)治療組和對(duì)照組中的c組、d組進(jìn)行照射。

1.3.4 MTT法檢測(cè)紅色毛癬菌的存活率 將上述經(jīng)過(guò)處理的治療組和4個(gè)對(duì)照組的紅色毛癬菌放入濕盒內(nèi)，35℃避光孵育后進(jìn)行MTT檢測(cè)，具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。為確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，以上研究步驟重復(fù)三次。所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組間多樣本均數(shù)比較行方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)照組a存活率為(96.1±2.4)%，對(duì)照組b存活率為(92.1±3.3)%，對(duì)照組c存活率為(97.1±1.2)%，對(duì)照組d存活率為(93.1±6.1)%，四者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明對(duì)照組中紅色毛癬菌的活性未受到明顯抑制。治療組中，當(dāng)ALA濃度分別為0.05%、0.125%、0.25%、0.5%、1.0%、1.25%、2.5%、5%和10%時(shí)，經(jīng)過(guò)PDT處理后，用MTT法檢測(cè)紅色毛癬菌的存活率分別為(86.1±3.3)%、(78.3±2.5)%、(69.7±1.7)%、(61.7±4.3)%、(48.9±5.1)%、(36.5±4.6)%、32.4±6.2)%、(30.6±3.2)%和(28.9±5.4)%。對(duì)以上存活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ALA濃度分別為0.05%、0.125%、0.25%、0.5%、1.0%、1.25%、2.5%時(shí)，對(duì)應(yīng)的存活率之間進(jìn)行兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而當(dāng)ALA濃度分別為2.5%、5%、10%時(shí)，其對(duì)應(yīng)的存活率之間進(jìn)行兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明當(dāng)ALA濃度從0.05%遞增至2.5%時(shí)，紅色毛癬菌的存活率依次遞減，存活率對(duì)ALA的濃度呈劑量依賴關(guān)系，而當(dāng)ALA濃度位于2.5%～10%時(shí)，紅色毛癬菌的存活率無(wú)明顯差異。

3 討論

紅色毛癬菌是導(dǎo)致皮膚真菌病的主要病原菌之一，在地域上多發(fā)生于濕熱的南方地區(qū)；好發(fā)人群為老年人或伴有糖尿病、腎病、惡性腫瘤等內(nèi)科疾病者。目前治療皮膚真菌病主要采用局部外用或系統(tǒng)使用抗真菌藥物的方法，但均難以防止復(fù)發(fā)。系統(tǒng)使用抗真菌藥物治療皮膚真菌病周期長(zhǎng)，費(fèi)用高，對(duì)肝腎有一定的毒副作用，更易導(dǎo)致真菌產(chǎn)生耐藥性；這些局限性制約了該方法在上述好發(fā)人群中的應(yīng)用。ALA-PDT已被廣泛用于臨床治療皮膚腫瘤，療效肯定，副作用少。本實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)估ALA-PDT在體外對(duì)紅色毛癬菌活性的抑制效應(yīng)，為將來(lái)使用ALA-PDT療法在臨床上治療皮膚真菌病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

光敏劑、激發(fā)光是ALA-PDT的基本要素，ALA是目前應(yīng)用最為廣泛的、可以局部外用的光敏劑。國(guó)內(nèi)外在體外進(jìn)行ALA-PDT抑制紅色毛癬菌活性的研究中，所獲得的研究結(jié)果差異很大，但普遍認(rèn)為ALA-PDT能不同程度殺滅或抑制紅色毛癬菌。但對(duì)ALA的濃度、使用何種化學(xué)試劑作為ALA的穿透促進(jìn)劑、ALA與紅色毛癬菌共同孵育的時(shí)間均有不同看法；通過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)和摸索，本實(shí)驗(yàn)的治療組采用ALA的濃度介于0.05%～10%之間，采用DMSO作為ALA的穿透促進(jìn)劑[6-7]，ALA與紅色毛癬菌共同孵育的時(shí)間為12 h。結(jié)果表明，ALA的濃度介于0.05%～2.5%之間時(shí)，經(jīng)過(guò)與ALA共同孵育12 h后再進(jìn)行PDT，紅色毛癬菌的存活率依次遞減，存活率對(duì)ALA的濃度呈劑量依賴關(guān)系。而當(dāng)ALA濃度介于2.5%～10%時(shí)，紅色毛癬菌的存活率無(wú)明顯差異。本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組中紅色毛癬菌的存活率未受到影響，說(shuō)明單純激光和只加ALA無(wú)激光光照，或紅色毛癬菌懸浮液加入ALA后，孵育時(shí)間不足，均對(duì)紅色毛癬菌的存活率無(wú)明顯的影響。因?yàn)閷?duì)照組不能同時(shí)具備光敏劑、激發(fā)光基本要素，因此不能引發(fā)ALA-PDT的治療作用，其充分說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)采用的方案是合理、有效的。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ALA必須與紅色毛癬菌共同孵育一定時(shí)間后才能產(chǎn)生足夠的PpIX。國(guó)外研究認(rèn)為不同種類的真菌，孵育的時(shí)間也不同；ALA的濃度達(dá)到一定值后，再增高ALA的濃度，PDT并不能提高對(duì)真菌的存活率的影響。究其原因，可能與紅色毛癬菌把ALA轉(zhuǎn)化為PpIX的能力以及孵育過(guò)程中pH的變化有關(guān)[8-9]。國(guó)外研究結(jié)果能夠部分解釋了本實(shí)驗(yàn)所獲得的成果，但本實(shí)驗(yàn)的例數(shù)、規(guī)模、各種觀察指標(biāo)和驗(yàn)證手段仍有待進(jìn)一步的深入研究，才能得出更精確的結(jié)論。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ALA-PDT在體外能有效地抑制紅色毛癬菌，ALA濃度為2.5%時(shí)抑制效果最好，可以作為ALA-PDT治療紅色毛癬菌引起的皮膚真菌感染的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但該療法應(yīng)用于人體的情況如何，仍需做更深入研究，有望成為治療皮膚真菌感染的新方法。

[1]梁 曉,韋英秀.1,3-β-D-葡聚糖檢測(cè)對(duì)糖尿病并發(fā)深部真菌感染診斷價(jià)值[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué),2013,13(4):478-480.

[2]Giuseppe M,Enrico MP,Maurizio B,et al.In vitroeffect of 5-aminolaevulinic acid plus visible light on Candida albicans[J].Photochemical&Photobioloqical Sciences,2004,3:419-422.

[3]Smijs TG,Schuitmaker HJ.Photodynamic inactivation of the dermatophyteTrichophyton rubrum[J].Photochemistry and Photobiology, 2003,77:556-560.

[4]Li X,Guo H,Tian Q,et al.Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm:an in vitro study[J].Journal of Surgical Research,2013,2: 1022-1027.

[5]梁 義,盧麗明,陳 勇,等.5-氨基酮戊酸光動(dòng)力學(xué)療法在體外對(duì)白念珠菌的抑制作用[J].海南醫(yī)學(xué),2013,24(5):1405-1407.

[6]Christensen E,M?rk C,Skogvoll E.High and sustained efficacy after two sessions of topical 5-aminolaevulinic acid photodynamic therapy for basal cell carcinoma:a prospective,clinical and histological 10-year follow-up study[J].Br J Dermatol,2012,6(6): 1342-1348.

[7]夏育民,劉小明,王首帆,等.0.1%二甲基亞砜促進(jìn)δ-氨基酮戊酸誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞光動(dòng)力學(xué)效應(yīng)[J].中華皮膚科雜志,2009,42 (9):628-631.

[8]Calzavara-Pinton PG,Venturini M,Capezzera R,et al.Photodynamic therapy of interdigital mycoses of the feet with topical application of 5-aminolevulinic acid[J].Photodermatol Photoimmunol Photomed,2004,20:144-147.

[9]Kamp H,Tietz HJ,Lutz M,et al.Antifungal effect of 5-aminolevulinic acid PDT inTrichophyton rubrum[J].Mycoses,2005,48: 101-107.

Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Trichophyton rubrum in vitro.

LIANG Yi,LU Li-Ming, CHEN Yong,YIN Qi.Liuzhou Railway Central Hospital,Liuzhou 545007,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo evaluate the effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Trichophyton rubrum in vitro.Methods96-well cell culture plates were used as experimental carriers for adding Trichophyton rubrum suspension,which were divided into experimental group and four control groups.He-Ne laser irradiation, 5-aminolevulinic acid and avoiding light incubation for 12 hours were given in the experimental group at the same time.But four control groups did not received three conditions at the same time.Then ALA-PDT was done under experimental conditions.The survival rate of Trichophyton rubrum was detected by MTT.ResultsWhen the concentration of ALA ranged from 0.05%to 2.5%,the survival rate of Trichophyton rubrum decreased in experimental group(P＜0.05).The survival rate and the concentration of ALA were in a dose-dependent manner.When the concentration of ALA ranged from 2.5%to 10%,there was no significant difference in the survival rate of Trichophyton rubrum(P＞0.05).The survival rate of Trichophyton rubrum in four control groups were not affected,and there was no significant difference(P＞0.05).ConclusionALA-PDT could effectively inhibit the growth of Trichophyton rubrum when ALA is within specific concentration range.

5-aminolevulinic acdi;Photodynamic therapy;Trichophyton rubrum;Inhibition

R379.2+2

A

1003—6350（2014）23—3436—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.23.1346

2014-06-27)

廣西衛(wèi)生廳課題（編號(hào)：Z2012552）

梁 義。E-mail：liangyi007030@sina.com