葡萄酒乳酸菌分子鑒定研究進展

李 凱，田淑芬

（天津市農科院葡萄研究中心，天津 300192）

蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，簡稱MLF）是葡萄酒釀造中非常重要的二次發酵過程。研究發現，只有部分乳酸菌（LAB）可進行蘋果酸-乳酸發酵。它們分屬于酒球菌屬（Oenococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus）[1]。國內外研究表明，能夠適應葡萄酒環境、較專一地進行蘋果酸-乳酸發酵并對酒質有增益作用的乳酸菌主要是酒酒球菌[2]，因此乳酸菌種類鑒定對于優良發酵特性菌株的篩選具有非常重要的意義。

乳酸菌分類鑒定方法可分為傳統方法和分子生物學方法。傳統分類鑒定方法主要是借助菌株間的表型性狀，但常煩瑣而耗時，且鑒定結果不夠準確。分子生物學的快速發展及其在細菌分類鑒定中的應用，是細菌的分類鑒定與菌株區分方法的一次革命[3]。科學家開始從分子和基因水平認識乳酸菌的遺傳結構、組成和分類，同時許多新的分子標記被用于乳酸菌的分類和鑒定，如16S rDNA序列分析、16S～23S rRNA基因間隔區（Intergenic Spacer Region，ISR）序列分析和基于 PCR技術的分子標記技術等，其中基于 PCR技術的分子標記又可分為擴增rDNA限制性酶切片段分析（Amplified RibosomalD NA Restriction Analysis，ARDRA）、隨機擴增多態性 DNA（Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、擴增片段長度多態性 （Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）等[4]。

1 16S rDNA/rRNA序列分析

16S rDNA/rRNA序列同源性分析是指用特定引物對供試菌株保守序列16S rDNA/rRNA進行特異擴增，并對擴增產物測序，測序結果與GenBank中已知序列進行BLAST分析，從而實現對目的菌株的鑒定。DU PLESSIS等綜合運用16S rRNA序列分析和種內特異性引物PCR來鑒定葡萄汁和白蘭地生產過程中分離出的54個菌株，其中大多數是酒酒球菌（22株），但也分離出少量短乳桿菌（8株）、益生菌（8株）和植物乳桿菌（6株）[5]。Koh等（2004）通過局部16S rDNA排序和系統進化分析來進行菌類鑒定，系統進化分析中，戊糖乳桿菌和植物乳桿菌16S rDNA有99.7% 的相似性[6]。Narvaez-Zapata，J.A等利用變性梯度凝膠電泳（DGGE）來分析16S rRNA基因，他們發現龍舌蘭酒中的乳酸菌群落主要由小片球菌、短乳桿菌、類布氏乳桿菌和植物乳桿菌組成，另外還在殘汁中發現了魏斯氏菌屬和芽孢桿菌屬這些非典型的屬[7]。16S rDNA/rRNA序列保守且鑒定結果的可靠，是目前細菌分類和鑒定經常使用的一種檢測方法，但該方法通常進行乳酸菌菌種間的鑒定，對于高同源性的乳酸菌菌株之間分辨率不高，而且該方法費時且成本較高，在生產上的推廣受到限制。

2 16S～23S rRNA間隔序列分析

16S～23S rRNA基因（ITS）是 16S rRNA 基因與23S rRNA基因的間隔序列，其進化速度是16S rRNA的10倍，具有可重復性和保守性，此外其16S rRNA端及23S rRNA端高度保守，故成為繼16S rRNA后又一新位點。周利國等利用16S～23S間隔序列對4株優選菌株進行同源性分析，通過與酒明串珠菌（Leuconostoc oenos）16S～23S間隔序列比對構建聚類圖，結果顯示4株菌16S～23S間隔序列的同源性為100%，推知這4株菌可能為同一類菌株[8]。該方法不但可用于菌種鑒定，還可以用于分辨16S rRNA不能鑒別的高同源性菌株[9]。

3 基于PCR技術的DNA分子標記

隨著DNA標記技術的不斷成熟，人們建立了一系列以DNA標記為基礎的微生物鑒定和檢測技術，根據菌株之間遺傳距離所產生的DNA指紋差異來直接反映供試菌株DNA多態性。這些技術的最大優勢是可以忽略各種復雜的微生物生長條件，不需要預先培養就可鑒定和檢測。多數研究結果表明，DNA標記分型技術具有從種屬到菌株各種水平的鑒別能力，為乳酸菌的快速分子鑒定和分型提供了新方法[10]。

3.1 擴增核糖體DNA限制性酶切片段分析（Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis，ARDRA）

ARDRA基于PCR技術選擇性擴增DNA片段，對所擴增片段進行限制性酶切，最后分析酶切后所得片段的多態性。該方法首先提取總DNA，以其作為模板，采用PCR技術擴增目的DNA，之后選擇多種有4～6個堿基識別位點的限制性內切酶對產物進行限制性酶切，并對酶切后的DNA片段進行聚類分析[11]。

Rodas，AM等先對16S rDNA進行擴增，然后用限制性內切酶（BfaI或MseI或AluI）對擴增產物進行酶切。他們按順序使用3種限制性內切酶簡化乳酸菌鑒定，先是MseI，然后是BfaI，最后若有必要，再用AluI。這種技術可以區別出36個參照乳酸菌種類中的32個，而且可以對葡萄汁和葡萄酒中的342個菌株進行鑒定，可鑒定出這些菌株屬于短乳桿菌、丘狀乳桿菌、棒狀乳桿菌、希氏乳桿菌、媚麗乳桿菌（益乳桿菌）、益生菌、腸膜明串珠菌、酒酒球菌、微片球菌和戊糖片球菌[12]。Manes-Lazaro，R等則綜合運用16S擴增性rDNA限制性片段分析和隨機擴增多態性DNA技術將西班牙博巴爾（Bobal）葡萄酒中10個乳酸菌菌株與它們的近似種區別開來[13]。

Marques，AP等發現距離16S rRNA基因5’末端大概300nt處存在酒酒球菌獨有的FseI識別序列（GGCCGGCC）。對于所有的酒酒球菌菌株，用pA和pH引物擴增都能獲得大約1560bp的16S rDNA擴增子，且在FseI酶切后都能獲得326和1233bp的兩個片段。酒酒球菌分子標記（326與1233bp片段）的檢測限要求菌落數達到102～103cfu/mL[14]。

劉樹文和余東亮以實驗室保存的23株酒酒球菌為供試材料，對擴增的16SrDNA特異條帶進行了酶切分析。結果表明，在確立的PCR體系上，均能擴增出一條長約995bp的特異條帶。酶切結果顯示，HindⅢ和MseⅠ酶切圖譜未顯示出菌株間的差別，表明了菌株間緊密的親緣關系。AluⅠ的酶切圖譜通過NT2SYSPC2.1軟件生成UPGMA聚類圖，在0.63水平上可以把23株菌區分為2個大類[15]。

ARDRA技術在葡萄酒乳酸菌鑒定中已經得到較好的應用，另外從理論上說，ARDRA分析中使用的限制性酶的種類越多，所產生帶型越多，最后結果越準確，但使用太多酶進行ARDRA分析會加大時間、人力和經費投入，因此優化限制性內切酶的數量和種類、篩選最佳的限制性內切酶組合對于ARDRA鑒別體系應是一個不斷完善的課題。

3.2 隨機擴增多態性DNA技術（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）

RAPD的基本原理是以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機多態核苷酸序列（通常為10個堿基對）為引物，在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，進行PCR擴增。擴增產物經瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測多態性。擴增產物的多態性反映了基因組的多態性。

RAPD技術在乳酸菌的鑒定分型中可作為其他技術的有力補充。Spano，G等便是聯合RAPD和物種特異性PCR技術對紅葡萄酒中植物乳桿菌進行種水平的鑒定[16]。Capozzi，V則是先用特定引物進行PCR來鑒定酒酒球菌，然后運用多元的RAPD-PCR分析進行進一步分類。這種多元方法可篩選有良好蘋乳發酵性能的酒酒球菌[17]。Solieri等用ARDRA和16S rRNA基因序列分析，鑒定出135株乳酸菌的120個酒酒球菌菌株，并運用基于M13的RAPD來研究酒酒球菌菌落的分子多樣性，并提出篩選新型酒類酒球菌發酵劑的框架圖[18]。Bartowsky等曾用RAPD對酒酒球菌的種內變種進行研究，他們通過RAPD成功區分澳大利亞不同產區15株菌中的10個，用4個RAPD引物和它們的基因相似性可鑒別6個商業酒酒球菌株，而來自同一個酒廠的酒酒球菌菌株則不能被區別開來。RAPD對未知來源的酒酒球菌進行分析時表現出更高靈敏度，從而能夠更好的對有良好發酵性能的酒酒球菌進行基因分析[19]。Ruiz，P等運用RAPD-PCR對Tempranillo葡萄酒中的微生物群進行分類，然后用分子和傳統方法進行鑒定。結果表明有一種酒酒球菌基因型在所有酒樣中同時存在，這種酒酒球菌可能是當地特有的，而且可能在葡萄酒釀造過程中起重要的作用[20]。

RAPD技術相對于其它多態性檢測技術來說方法簡便易行，可以直接對生物DNA進行多態性分析，研究所需DNA量極少，其引物沒有嚴格的種屬局限。但是RAPD技術也存在一定局限性，它是一種顯性標記，不能有效區分雜合子，穩定性差，可重復性小，對反應條件變化十分敏感。Taq聚合酶的來源、DNA的不同提取方法、PCR儀的不同型號都會影響檢測的結果。因此，在RAPD研究中需要嚴格控制DNA模板的質量和擴增反應條件。

3.3 限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism）

RFLP是1986年由Pedersen等人發明的一項分子標記技術。限制性內切酶能夠識別雙鏈DNA分子中的特異核苷酸序列，并且在特異位點切割DNA分子，產生一系列大小各異，長短不一的DNA限制性片斷。由于不同的種，菌株等個體中的DNA核苷酸序列既同源又存在遺傳變異性，所以經過限制性內切酶的酶切消化，同源DNA限制片斷在不同來源個體中的長度可能有所變異，這種變異就稱為限制性片段長度多態性。RFLP是可以用于種內水平鑒定乳酸菌分離株的一種DNA指紋方法。Claisse，O等（2007）運用PCR-RFLP分析rpoB基因序列從而鑒定分離自葡萄酒的乳酸菌種類。先通過固體培養基和顯微鏡觀察來區別球菌和桿細胞，之后用AciI對球菌進行單一的酶切消化，同時用AciI，HinfI和MseI對桿菌進行2個或3個酶切消化，7個球菌菌株和12個乳酸桿菌便被準確鑒定[21]。

RFLP也存在一定缺點，如要大量高純度DNA、步驟煩瑣、探針不易制備、周期長、只能檢測限制性內切酶識別位點上的變異等，但是該方法可在種內水平鑒定乳酸菌菌株的DNA指紋方法，而且特別適用于構建遺傳連鎖圖，在分析種群內和種群間的遺傳差異時非常有用。

3.4 擴增片段長度多態性（Amplified Fragment Length Polymorphism）

AFLP的基本原理是對基因組DNA進行酶切，用特殊的接頭連接DNA片斷的兩端形成特異片斷，接頭序列和相鄰的限制性位點序列作為引物結合位點。利用PCR以及PAGE技術進行擴增和分離鑒定。AFLP比RAPD和RFLP技術有更大的優越性，主要用于流行病學及食品源性病原體毒力指標的測定研究（如李斯特桿菌和沙門菌），也可利用該技術對種族遺傳關系密切的菌種（戊糖乳桿菌、植物乳桿菌和類植物乳桿菌）進行種水平的鑒定[22]。金剛利用帶有一個選擇性堿基的四條引物對酒酒球菌基因進行單限制性酶切擴增片段長度多態性（SE-AFLP）分析，該方法可將22株酒酒球菌完全區分開，因此SE-AFLP分子標記技術可用于酒酒球菌菌株區分[23]。AFLP具有多態性豐富，共顯性表達，不受環境影響，無復等位效應，帶紋豐富，用樣量少，靈敏度高，快速高效等優點，已成為實驗室鑒定酒酒球菌的常規方法。

3.5 聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（PCRDGGE）

PCR-DGGE是基于不同堿基序列的DNA雙鏈解鏈時需要不同的變性劑濃度的原理，DNA雙鏈一旦解鏈，其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度會急劇下降，因此將PCR擴增得到的等長DNA片段加入到含有變性劑梯度的凝膠中進行電泳，序列不同的DNA片段就會在各自相應的變性劑濃度下變性，發生空間構型的變化，導致電泳速度的下降，停留在與其相應的不同變性劑梯度位置，染色后可以在凝膠上呈現不同的條帶。Giusto，C等先對16S rDNA基因V1區域的DNA片段PCR擴增，然后進行DGGE來鑒定葡萄酒生產中常用活性干酵母中的乳酸菌，他們鑒定出活性干酵母中的乳酸菌主要是乳酸桿菌和片球菌[24]。Ruiz，P等通過 PCR-DGGE鑒定出Tempranillo葡萄酒蘋乳發酵時的菌落群體包括氧化葡糖桿菌、沙雷氏菌屬、腸桿菌屬的菌株以及酒酒球菌，酒酒球菌是葡萄酒蘋乳發酵過程中的優勢菌種[25]。

PCR-DGGE技術可以鑒定蘋果酸乳酸發酵過程中乳酸菌的種群差異，另外該技術在分析微生物的遺傳多樣性方面也有明顯的優勢，但是DGGE技術一般只能分析小于500個堿基對的DNA片斷，得到相關信息少，試驗過程中又常出現共遷移條帶，因此在分析鑒定乳酸菌時存在較大困難。鑒于此，對于復雜菌落，在進行鑒定工作時可以先通過一些方法降低其分析的復雜度。比如先根據不同的GC含量，將基因組總DNA分成各個部分，再分別進行PCR-DGGE分析[26]，從而降低分析微生物多樣性時復雜度。

4 種屬特異性PCR鑒定（species-specificPCR）

Zapparoli，G等設計了一對特異性引物，用于擴增酒類酒球菌編碼蘋果酸乳酸酶（Malolactic enzyme，MLE）基因的特異性序列，共 1025bp，并用電泳檢測擴增結果，這種方法就是種屬特異性PCR（species-specific PCR）鑒定[27]。

劉延琳等以Oenococcusoeni蘋果酸-乳酸酶基因（mleA）為目標基因，設計了1對特異性引物PmleaL/PmleaR，直接以Oenococcus oeni的菌落為模板，通過引物對PmleaL/PmleaR的PCR擴增，可得到mleA基因的特異性條帶；用此特異性引物進行供試乳酸菌的PCR鑒定，所有Oenococcus oeni菌系均得到特異性條帶，而供試的其它種類乳酸菌未擴增出目標帶[28]。PmleaL/PmleaR可用于Oenococcus oeni的快速PCR鑒定。Cappello，MS等聯合 species-specific PCR和 16S rRNA序列分析，在220株乳酸菌中鑒定出87株為酒酒球菌[29]。王華等采用species-specific PCR對酒酒球菌進行鑒定，嘗試通過優化反應體系和反應條件，直接使用菌液和菌落作為模板進行擴增。在優化后的反應體系下，可直接使用菌液或菌落作為模板進行擴增，擴增結果穩定，條帶清晰[30]。種屬特異性鑒定方法快速可靠，節約成本，可被廣泛應用于酒類酒球菌的鑒定。

5 熒光原位雜交法（FISH）

熒光原位雜交法（FISH）是采用免疫熒光標記的寡核苷酸探針與目標檢測物進行原位雜交，計算雜交率來定量檢測和鑒定細菌。Blasco，L等提出了一種基于FISH快速鑒定乳酸菌的方法，運用于葡萄酒中常見乳酸菌16S rDNA同源的熒光寡核苷酸探針進行鑒定。該方案在36個參照菌株的雜交的基礎上對乳酸菌進行特定檢測，探針的專一性可用純培養進行評估。探針可鑒定不同葡萄酒中的乳酸菌種類，這使得對不經過培養的自然樣本進行直接的鑒定和量化成為可能[31]。

熒光原位雜交法在乳酸菌快速鑒定中有廣闊的發展前景，在4～16h便可以得出比較準確的鑒定結果。FISH可優先檢測數量上占優勢的細菌。與PCR方法相比，它不需要選擇性純化或擴增，可提供一個更詳細的微生物圖譜。

6 序列特異性擴增區（Sequence—characterized Amplified Region，SCAR）

SCAR標記是將目標RAPD片段進行克隆并對其末端測序，根據RAPD片段兩端序列設計特異引物，對基因DNA片段進行PCR特異擴增，把與原RAPD片段相對應的單一位點鑒別出來。Solieri，L和 Giudici，P使用SCAR方法鑒定蘋乳發酵中的酒酒球菌菌株。試驗以酒酒球菌LB221為模板菌株，基于特異性的PAPD片段，在原先的RAPD引物兩端延伸9～13個堿基設計出SCAR標記引物，該特異引物可以擴增出LB221特有的唯一條帶[32]。

SCAR標記是共顯性遺傳，待檢DNA間的差異可直接通過有無擴增產物來顯示。SCAR可以用于酒酒球菌或者是其它乳酸菌的株間鑒定，而且該方法方便、快捷、可靠，可以快速檢測大量個體，結果穩定性好，重現性高，但關于葡萄酒乳酸菌的SCAR標記研究較少，因此SCAR標記對于釀酒乳酸菌的株間鑒定以及對優良性狀連鎖基因的標記具有很廣闊的研究空間。

7 脈沖場凝膠電泳

脈沖場凝膠電泳（PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一種分離大分子DNA的方法。在普通的凝膠電泳中，大的DNA分子（>10kb）移動速度接近，很難分離形成足以區分的條帶。在脈沖場凝膠電泳中，電場不斷在兩種方向（有一定夾角，而不是相反的兩個方向）變動。DNA分子帶有負電荷，會朝正極移動。相對較小的分子在電場轉換后可以較快轉變移動方向，而較大的分子在凝膠中轉向較為困難。因此小分子向前移動的速度比大分子快。脈沖場凝膠電泳可以用來分離大小從10kb到10Mb的DNA分子。Lopez等利用脈沖場凝膠電泳和隨機擴增多態性DNA技術對植物乳桿菌和酒酒球菌進行了基因典型化分析。脈沖場凝膠電泳可以用來鑒別、檢測葡萄酒發酵過程中的菌株，對植物乳桿菌和酒酒球菌菌株的辨識能力較高[33]。

8 總結與展望

葡萄釀酒乳酸菌在葡萄酒釀造，特別是干紅葡萄酒釀造中起著重要的作用。乳酸菌表型生化鑒定法耗時耗力，而且培養和生化鑒定結果易受到培養條件等諸多因素的影響，且主要缺點在于無法反應菌株的核酸信息。而分子鑒定，特別是基因型鑒定法準確、快速、靈敏，且分辨率高，已廣泛用于釀酒乳酸菌的分類鑒定。但是由于每種方法基于的原理不同和各種檢測方法的優勢不同，各種方法都有一定的選擇性和局限性。目前，還沒有一種方法能單獨完成各種物種各種水平的檢測。所以，只有聯合各種鑒別方法，充分利用各種方法的優勢，才能得到更為便捷、準確和靈敏的乳酸菌的分類和鑒別。

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