獅棘球絳蟲(Echinococcus felidis)生物學特性研究進展

劉聰暖，婁忠子，李 立，范彥雷，閆鴻斌，賈萬忠

細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)是重要人獸共患寄生蟲病——棘球蚴病的病原，其種內變異現象廣泛存在，因此細粒棘球絳蟲有狹義種(sensu stricto)和廣義種(sensu lato)之分。 前者包括G1-G3基因型復合群，后者包括G4-G10基因型和獅株(Lion strain)，其中G4基因型(馬株)被重新確立為馬棘球絳蟲(E.equinus)，G5基因型(牛株)被重新確立為奧氏棘球絳蟲(E.ortleppi)，G6-G10被重新確立為加拿大棘球絳蟲(E.canadensis)。細粒棘球絳蟲獅株最早由Ortlepp在1937年命名為獅棘球絳蟲，病原體來自于南非的虎獅。將其作為一個新種進行描述是基于其吻鉤皺褶明顯和以貓科動物而非犬科動物作為終末宿主，這在細粒棘球絳蟲復合群中是唯一的或獨特的[1]。由于獅株具有吻鉤皺褶明顯的形態學特點，且其線粒體基因組序列與其它基因型之間差異較大，因而一些專家和學者據此建議也將其獨立設種，稱之為獅棘球絳蟲(E.felidis)[1-2]。不同的蟲種、蟲株(基因型)在幼蟲(包囊)形態、對人的致病性、宿主范圍、流行病學意義等方面存在差異，這些特性或者特征對疫苗、診斷試劑及抗蟲藥物的研制和開發具有重要意義[3-4]。本文特簡要概述獅棘球絳蟲(物)種生物學特性研究取得的進展。

1 基因分子遺傳標記特征

1.1線粒體cox1和nad1基因片段序列 細粒棘球絳蟲G1-G3基因型復合群擁有廣闊和交叉的地理分布及宿主范圍[5-8]，因此細粒棘球絳蟲G1-G3基因型可以被當做一個獨立單一的分類單元，即細粒棘球絳蟲狹義種[3,8-9]。近年來，在Hüttner等人的研究中，獅棘球絳蟲的分類地位與G1-G3基因型復合群相近，但最新的分子生物學研究結果認為，獅棘球絳蟲與G1-G3基因型復合群是姊妹種[1]?？紤]到最近從烏干達獅糞便中提取的蟲卵DNA序列與在南非已保存40年的獅棘球絳蟲成蟲的DNA序列一致，因而獅棘球絳蟲可以成為一個獨立的基因型，并選用新近測定的源自烏干達的獅棘球絳蟲樣品基因序列作為其DNA分子信息分析的依據。

起初對細粒棘球絳蟲的基因分型和蟲株內遺傳變異性分析是通過對線粒體cox1和nad1基因片段的序列比對來實現的[6,9-13]。獅棘球絳蟲(源自烏干達樣品)線粒體基因組序列(登錄號：AB732958)中cox1(366 bp：cox1基因全長序列中第745～1110區段)和nad1(471 bp：nad1基因全長序列中第136～606區段)基因片段序列與細粒棘球絳蟲G1基因型序列(登錄號：AB786664)相比較，發現其自身的一些分子遺傳標記特征。

通過對獅棘球絳蟲和細粒棘球絳蟲G1基因型序列的比較表明，cox1的堿基突變有27個，主要有A突變為G(共16個)，其它為A、G和C突變為T(11個)，兩個序列間的核苷酸差異性為7.8%；nad1的堿基突變共有64個，其堿基突變主要為A突變為G(共33個)，其次為C突變為T(共21個)，少數為A、G突變為T(10個)或者G突變為C(1個)；兩個序列間的核苷酸差異性為15.8%。獅棘球絳蟲cox1和nad1基因序列與細粒棘球絳蟲G1-G3復合群以外其它棘球絳蟲的序列差異相近或者更大,見表1。

表1獅棘球絳蟲和其它棘球絳蟲之間線粒體基因和核基因核苷酸序列差異的比較[1]

Tab.1Comparisonsofpairwisedivergence(%)ofmitochondrialandnuclearDNAsequencesbetweenE.felidisandotherE.granulosussensulato

Species (Genotype)Mitochondrial genesNuclear genes cox1nad1cobrrnef1αElpE. granulosus (EgG1)8.417.111.66.61.41.7E. equinus (EgG4)8.116.712.47.6--E. ortleppi (EgG5)10.618.414.88.90.91.5E. canadensis (EgG6)10.617.914.89.21.01.6E. canadensis (EgG7)10.517.915.09.21.0-E. canadensis (EgG8)11.119.315.08.60.9-E. canadensis (EgG9)10.517.915.09.21.0-E. canadensis (EgG10)9.715.513.010.71.01.6

Note: The complete sequences of mitochondrialcox1,nad1,cobandrrngenes are used in analysis of pair nucleotide divergence,while the partial nuclear genes ofefla andelpare used. G9 found in the Poland patient is probably a variant of genotype G7[15,18,19],and Saarma et al[8]report that genotypes G6,G7,and G9 are located in the same position of the same phylogenetic branch,which is constructed based on mitochondrial genomes and nuclear DNA sequences. Therefore,we consider the sequences divergence betweenE.felidisandE.canadensisG9 to be equal with that betweenE.felidisandE.canadensisG7.

1.2核DNA序列

1.2.1核基因編碼序列 僅用線粒體DNA序列構建進化樹存在誤差風險，這是由于線粒體DNA的母性遺傳不一定與真實的物種進化過程相符合，從而對進化過程造成誤判[14-15]。因此，除了用線粒體DNA作為進化分子標記特征外，多種核DNA也逐漸被作為分子標記而廣泛應用[15]。如：elp(ezrin-radixin-moesin- like protein，埃茲-根蛋白-膜突蛋白樣蛋白 )、ef1a(elongation factor 1 alpha，延伸因子1α)、pepck(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)、pold(DNA polymerase delta，DNA 聚合酶δ)基因或基因片段序列。

通過比較獅棘球絳蟲和細粒棘球絳蟲狹義種的序列發現，elp基因(獅棘球絳蟲的登錄號為EF558360，細粒棘球絳蟲G1基因型的登錄號為EU834886)共有15個堿基突變，其堿基突變主要為G突變為A(共5個)，其次為A突變為G(3個)，T突變為C(4個)，少數為G突變為T(1個)，G突變為C(1個)，C突變為T (1個)；兩個序列間的核苷酸差異性為1.7%。

ef1a基因(獅棘球絳蟲的登錄號為FN568379，細粒棘球絳蟲的登錄號為FN568380)共有13個堿基突變，其堿基突變主要為T突變為C(共5個)，其次為C突變為T(3個)，少數為T突變為G(1個)，A突變為G(1個)，G突變為A(1個)，C突變為A(1個)，G突變為T(1個)；兩個序列間的核苷酸差異性為1%。

pepck基因(獅棘球絳蟲的登錄號為FN567989，細粒棘球絳蟲狹義種的登錄號為FN567990)共有10個堿基突變，其堿基突變主要為A突變為G(共4個)，C突變為T(共4個)，其次為G突變為A(1個)，T突變為C(1個)；兩個序列間的核苷酸差異性為0.7%。

pold基因(獅棘球絳蟲的登錄號為FN568360，細粒棘球絳蟲狹義種的登錄號為FN568361)共有15個堿基突變，其堿基突變主要為A突變為G(共6個)，其次為C突變為T(4個)，G突變為A (3個)，少數為C突變為G(1個)，G突變為T(1個)；兩個序列間的核苷酸差異性為1.4%,見表2。

表2獅棘球絳蟲和細粒棘球絳蟲狹義種之間核基因核苷酸序列差異的比較

Tab.2Comparisonsofpairwisedivergencevalues(%)ofnuclearDNAsequencesbetweenE.felidisandE.granulosussensustricto

Nuclear genesAcession no. E. granulosus sensu strictoAcession no. E. felidisPairwise divergenceThe main mutations between E. felidis and E. granulosus sensu stricto elpEU834886EF5583601.7G→A eflaFN568380FN5683791.0T→CpepckFN567990FN5679890.7A→G C→TpoldFN568361FN5683601.4A→G

1.2.2核糖體rRNA基因序列 內轉錄間隔區序列1(ITS1)：對獅棘球絳蟲分離株(NCBI登錄號：FJ426641-FJ426646)和細粒棘球絳蟲G1-G3基因型(NCBI登錄號：AY969043)的ITS1序列進行比對分析發現，獅棘球絳蟲分離株有2～3個序列缺失位點，其大小分別為18 bp，3 bp和54 bp，其中54 bp的缺失位點只在個別分離株中出現(例如：NCBI登錄號：FJ426643和FJ426646)。此外，獅棘球絳蟲分離株與細粒棘球絳蟲G1-G3基因型還有12個可能的突變位點，這些零散的突變位點只是在部分獅棘球絳蟲分離株中出現，并不適用于設計特異性引物對獅棘球絳蟲分離株進行區別鑒定。獅棘球絳蟲分離株ITS1的缺失位點使通過種間特異性聚合酶鏈反應區別獅棘球絳蟲分離株和細粒棘球絳蟲G1-G3基因型成為可能，在18 bp和54 bp兩個序列缺失位點設計引物可以完成細粒棘球絳蟲G1-G3基因型的PCR擴增，而在獅棘球絳蟲分離株中則無擴增結果。

18S rRNA基因序列(18S rDNA)：對獅棘球絳蟲和細粒棘球絳蟲的18S rDNA 序列進行比對分析發現，獅棘球絳蟲有2個序列插入位點，其大小分別為10 bp和5 bp；此外，獅棘球絳蟲(獅棘球絳蟲的登錄號為AB731638)和細粒棘球絳蟲(細粒棘球絳蟲的登錄號為GQ260092)有35個堿基突變，其堿基突變主要為A突變為G(10個)，G突變為A(8個)，T突變為C(6個)，其次為C突變為G(4個)，C突變為T(3個)，少數為T突變為G(2個)，G突變為T(1個)，C突變為A(1個)；兩個序列間的核苷酸差異性為1.6%。

2 與細粒棘球絳蟲其它蟲株(基因型)的親緣關系

最近的研究表明，獅棘球絳蟲與細粒棘球絳蟲G1-G3基因型復合群分類單位親緣關系相近，二者的分類地位為姊妹種關系。在此基礎上，以目前所有可用的數據為基礎，可以得出獅棘球絳蟲和細粒棘球絳蟲G1-G3復合群基因型在具有共同祖先的結論，但目前前者已經演化成一個獨立的系統發育實體，甚至極有可能也演化成為一個獨立的種[1,8]。

對獅棘球絳蟲線粒體基因DNA全長序列(cox1、nad1、cob和rrn)，用最大似然法和貝葉斯推論，確定獅棘球絳蟲的分類地位及與其它棘球絳蟲的系統發育關系。細粒棘球絳蟲狹義種和細粒棘球絳蟲獅株一對新的姊妹種關系就是通過最大似然法和貝葉斯推論被確認，并通過引導比例和貝葉斯后驗概率的高度準確性給這些姊妹種關系提供了后驗支持。通過貝葉斯推論得到的進化樹顯示細粒棘球絳蟲狹義種和獅棘球絳蟲在已經確定的分類中形成了最基礎的譜系，并展示了它們親緣關系的程度。此后，細粒棘球絳蟲進化樹也通過由cox1、nad1 和cob翻譯而來的線粒體蛋白質序列而被重新構建。雖然最大似然法和運用蛋白質數據進行貝葉斯推論產生的一個進化樹，在關于馬棘球絳蟲(E.equinus)的分類地位和福氏棘球絳蟲(E.vogeli)的分類地位以及涉及少節棘球絳蟲(E.oligarthra)的方面存在一些不同，但細粒棘球絳蟲狹義種和獅棘球絳蟲的姊妹種關系仍然被這兩種分析方法所高度支持[1]。

獅棘球絳蟲和其它種類棘球絳蟲的線粒體DNA和核DNA序列對比所產生的差異度見表1，其中獅棘球絳蟲與其它棘球絳蟲線粒體DNA的差異性在6.6%～19.3%之間，且即使是與與其有姊妹種關系的細粒棘球絳蟲狹義種的線粒體DNA的差異性也在6.6%～17.1%之間。獅棘球絳蟲與其它棘球絳蟲核DNA的差異性在0.9%～1.7%之間，但是獅棘球絳蟲與與其親緣關系最近的細粒棘球絳蟲狹義種核DNA的差異性在1.4%～1.7%之間，差異也很明顯[1]。通過對烏干達獅株和細粒棘球絳蟲G1型(登錄號：NC_008075)線粒體基因組的部分基因進行比較分析，發現獅株與G1基因型的cox1序列相似性為92.6%，nad1序列相似性為87.2%，atp6的序列相似性為86.8%，cox2的相似性為89.6%，cox3的相似性為90.4%，nad2的序列相似性為88.6%，nad3的序列相似性為89.7%，nad4的序列相似性為87.6%，nad4L的序列相似性為93.6%，nad5的序列相似性為85.4%，nad6的序列相似性為88.1%，cob序列相似性為90.5%。諸多比較發現，棘球絳蟲獅株和細粒棘球絳蟲G1型線粒體多個基因的相似度較高，均在85%以上，這也是棘球絳蟲獅株與細粒棘球絳蟲G1-G3基因型能夠作為姊妹種的分子基礎。

線粒體DNA和核DNA在進化分析上也具有明顯的差異，當用線粒體DNA進行進化分析時，細粒棘球絳蟲G1-G10基因型和獅棘球絳蟲屬于并系關系，少節棘球絳蟲與其它種類的棘球絳蟲屬于姊妹種關系[1,9,16-17]，而用核蛋白編碼基因進行進化分析的結果顯示，細粒棘球絳蟲是一個單一居群，多房棘球絳蟲(E.multilocularis)與細粒棘球絳蟲屬于姊妹種關系。然而，盡管線粒體DNA和核DNA在進化分析上具有明顯的差異，但是二者的進化分析均表明獅棘球絳蟲和細粒棘球絳蟲狹義種屬于姊妹種關系,圖1。[8,17]

圖1對于最近發表的關于棘球絳蟲分子系統發育關系的總結[17]

Fig.1Summaryofnewly-publishedmolecularphylogenetictreesforthegenusEchinococcus

(a) The phylogenetic tree was constructed based on mitochondrial DNA sequences[1,9].

(b) The phylogenetic tree was constructed based on nuclear protein-coding genes sequences[8]. The shadow area indicates the category shift based on mitochondrial DNA sequences. The starred parasites show that their hosts are the wild mammals,meanwhile,HA stands for Holarctic region,TI for Tibet,ET for Ethiopia and NT for Neotropical region,and the other unmarked species use the mammals from Japan as the host distributing all over the world[17].

3 獨立種地位與物種形成(進化史)

獅棘球絳蟲與細粒棘球絳蟲狹義種DNA序列差異性同多房棘球絳蟲與石渠棘球絳蟲(E.shiquicus)之間的差異相當，但是要遠遠高于奧氏棘球絳蟲與加拿大棘球絳蟲之間的差異，同時也遠遠高于公認的帶屬(Taenia)絳蟲中的亞洲帶絳蟲(T.asiatica)和牛帶絳蟲(T.saginata)間的差異[9,20]。此外，廣泛地理分布上的各分離株即新近從烏干達采集的分離株和保存于20世紀60年代南非分離株在遺傳學上保持一致，同時獅棘球絳蟲具有明顯不同的形態學特征和以獨特的獅類為終末宿主[21]。這些證據都充分支持了獅棘球絳蟲具有獨立種地位。

根據線粒體DNA序列[1]和部分核基因DNA序列[17]認為，獅棘球絳蟲很明顯是細粒棘球絳蟲狹義種的姊妹種，推測它們有一個共同的亞洲祖先，這是基于現代貓科動物起源于亞洲[22]這一觀點得出的結論。非洲獅(Pantheraleo)是從上新世晚期生活在亞洲一帶的祖先世系進化來的[22]，然后在早更新世期間侵入非洲領地棲息。假定在亞洲一帶就出現了獅棘球絳蟲和細粒棘球絳蟲狹義種的分化，則前者便在早更新世之后隨非洲獅一起被帶到了非洲。獅子在有史以來分布廣泛，包括印度、中東和非洲等地，但是現在僅散布于非洲及印度部分區域[23]。根據Hüttner等人的調查，獅棘球絳蟲是烏干達伊麗莎白女王國家公園獅子一種普通的寄生蟲[15]。

4 鑒定方法

對ITS1基因進行RFLP-PCR(限制性片段長度多態性-聚合酶鏈反應)和對12S rRNA基因進行種間特異性聚合酶鏈反應都不能區別獅棘球絳蟲和細粒棘球絳蟲狹義種，細粒棘球絳蟲和獅棘球絳蟲12S rRNA僅有2個和3個核苷酸的差異，不能防止獅棘球絳蟲12S rRNA的非特異性擴增。而對nad1基因進行限制性片段長度多態性-聚合酶鏈式反應檢測，經過Hph1限制性內切酶消化的nad1 PCR產物的帶型與所有已知的棘球絳蟲的帶型之間存在差異，在細粒棘球絳蟲狹義種和獅棘球絳蟲之間存在明顯的差異，但是在細粒棘球絳蟲狹義種G1、G2和G3之間并無差異。通過對nad1 PCR產物進行酶切消化后，可以觀察到較短的條帶，但這種條帶在普通的瓊脂糖凝膠電泳圖上無法觀察?，F有數據庫中有大量可以參考的cob基因序列，因此可以對cob基因進行限制性片段長度多態性-聚合酶鏈式反應，從而確定樣品來自于何種宿主。cob基因的片段較短，但可以選用Hph1限制性內切酶，它可以將來自于獅子，豹和黑斑鬣犬的樣品清楚的區分開[24]。當然，隨著愈來愈多DNA序列的積累，可為設計獅棘球絳蟲特異性PCR等分子生物學方法提供重要依據，以期建立一系列以DNA-PCR為基礎的分子流行病學調查和蟲種鑒定方法。

5 流行病學特征

對獅棘球絳蟲進行準確鑒定，其目的在于對病原體的傳播途徑、人和動物易感性等流行病學數據與信息進行準確分析，為疾病的有效控制提供重要依據。據文獻報道，獅棘球絳蟲不僅存在于獅體，還可寄生于其它食肉動物。人或動物的囊型包蟲病，可由G1-G10基因型細粒棘球絳蟲和獅棘球絳蟲引起，除獅棘球絳蟲外，所有其它細粒棘球絳蟲都能以家犬作為中間宿主。在烏干達西部的一個國家公園進行的調查顯示，大部分在此飼養的獅子都被獅棘球絳蟲所感染，在同一地理位置的疣豬體內，也能發現含有獅棘球蚴的囊泡[25]。獅棘球絳蟲的中間宿主主要為斑馬、牛羚、疣豬、藪豬、水牛和各種羚羊，但是否以長頸鹿和河馬為中間宿主，目前還有待于進一步證實，但其終末宿主，現在的發現僅限于獅子[3,26]。由于沒有確定的診斷標準，診斷獅棘球絳蟲感染的難度大，因而對其宿主范圍和地理分布的了解尚少，且有關其中間宿主范圍的資料也很少。同時，沒有確實的證據證明獅子是唯一的終末宿主，其它貓科動物、犬科動物、鬣狗科動物是否參與到其生活史也尚未可知[1,27]，其對人是否具有致病性也有待進一步研究[1,3-4,26,28]。

獅棘球絳蟲主要分布于埃塞俄比亞、南非、烏干達和東非保護區[3-4,24-25,27]。由于獅棘球絳蟲與細粒棘球絳蟲狹義種的親緣關系很近，而細粒棘球絳蟲狹義種是世界范圍內人類感染棘球絳蟲的主要種類，因此獅棘球絳蟲有引起人類感染的潛在可能性。但獅子大多數被限制在很少有人類活動的國家公園和狩獵保護區，它可能對東非一些仍與野生動物共存的牧民有一定的影響，例如肯尼亞和坦桑尼亞的馬賽人，但它對這些區域以外公眾健康的危害性可能很小[1,26]。

6 研究中存在的問題

獅棘球絳蟲的研究目前尚少，其主要原因可能是相關研究材料獲取困難所致。就目前的研究結果表明，獅棘球絳蟲的終末宿主僅為獅子，中間宿主種類雖然較多，但主要是非洲熱帶草原上野生動物，病原材料的獲取非常困難。僅僅是從野外獲取獅子糞便，就需要嚴格的安全防護措施以防范獅子等野生動物對人類的攻擊，并需要對獅子的生活習性和糞便特征極為了解的人員陪同收集，其獲取難度可想而知。對獅棘球絳蟲的鑒定，跟其它寄生蟲的鑒定一樣，也是從形態學特征和分子遺傳標記特征兩方面入手，但獅棘球絳蟲與細粒棘球絳蟲G1-G10基因型的形態特征極為相似，只有以吻鉤皺褶作為區分標準，無其它明顯的眼觀特征，因此從形態學上很難區分。獅棘球絳蟲的主要分子遺傳標記與其它棘球絳蟲的差異度在0.9%～22.9%之間，多數分子標志的差異度在10% 左右，因而是鑒定獅棘球絳蟲較為理想的方法，但目前以之為基礎的分子生物學鑒定方法因方法復雜，尚有諸多技術性問題需要解決。

7 未來研究方向

目前用于鑒定的獅棘球絳蟲分離株數目有限，鑒定的分子靶標主要集中于線粒體cox1、nad1、cob、rrnS和rrnL基因，以及核ITS1、elp、ef1a、pepck、pold基因或基因片段序列，序列信息量有限，因此一方面應增加分離株的數目，以期獲取更多群體的核苷酸變異信息，另一方面應在使用原來分子標記的同時應分離與鑒定新的有價值的分子遺傳學標記，以便有助于精確鑒定獅棘球絳蟲蟲種(蟲株)和分析其群體遺傳變異規律。

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