弓形蟲(chóng)棒狀體分泌毒性因子－假激酶的研究進(jìn)展

趙桂華，郝萬(wàn)東，尹 昆

2.山東省金鄉(xiāng)第一中學(xué)，金鄉(xiāng) 272299

弓形蟲(chóng)為專性胞內(nèi)寄生致病原蟲(chóng)，屬頂復(fù)門(mén)，呈世界分布，中間宿主廣泛，可感染包括人類在內(nèi)的所有有核細(xì)胞。全世界約有三分之一的人感染，多數(shù)呈隱性感染，但對(duì)于免疫功能低下及受損人群危害重大，可引起死亡。因其復(fù)雜的生活史及致病機(jī)制，目前尚無(wú)高效的藥物能夠徹底清除隱性感染者及病人體內(nèi)的蟲(chóng)體及包囊，也無(wú)安全有效地疫苗可用。弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白（ROPs）是蟲(chóng)體分泌于宿主細(xì)胞的效應(yīng)因子，在蟲(chóng)體的入侵、納蟲(chóng)泡形成、增殖、出胞和逃避宿主細(xì)胞效應(yīng)分子的攻擊中發(fā)揮重要作用。ROPs屬蛋白激酶家族，被稱為棒狀體蛋白激酶（ROPKs），決定弓形蟲(chóng)毒力，是研制弓形蟲(chóng)藥物潛在靶點(diǎn)和疫苗的理想對(duì)象。隨著對(duì)弓形蟲(chóng)ROPKs研究的深入，發(fā)現(xiàn)決定蟲(chóng)體毒力的許多基因編碼一種無(wú)催化活性的蛋白激酶，稱為假激酶（Pseudokinase）。這種酶雖無(wú)激酶活性，但它們可通過(guò)非磷酸化的方式發(fā)揮作用，成為弓形蟲(chóng)不可或缺的毒性因子。假激酶與ROPKs其它成員一樣具有調(diào)控宿主細(xì)胞信號(hào)通路，協(xié)助蟲(chóng)體逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊的功能，成為弓形蟲(chóng)病免疫診斷、疫苗研制和抗弓形蟲(chóng)藥物篩選的潛在靶點(diǎn)[1]。假激酶的研究是目前研究的熱點(diǎn)，對(duì)弓形蟲(chóng)病防治意義重大。本綜述就近年來(lái)弓形蟲(chóng)棒狀體分泌的假激酶的研究進(jìn)展做一概述，認(rèn)識(shí)它們的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，揭示它們的作用機(jī)制，完善弓形蟲(chóng)的致病機(jī)理。

1 弓形蟲(chóng)棒狀體假激酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及命名

假激酶于2002年由Gerard Manning等在研究人類基因組草圖中編碼蛋白激酶的基因時(shí)發(fā)現(xiàn)并正式命名。人類蛋白激酶大約有10%屬于假激酶，它們至少缺失一種激酶催化活性所必需的3個(gè)關(guān)鍵氨基酸（賴氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸），導(dǎo)致喪失激酶活性[2]。隨后的研究證明假激酶在生物界普遍存在，幾乎遍布所有蛋白激酶家族，其中弓形蟲(chóng)的含量最高，占總蛋白激酶的30%（160余個(gè)）[3]。目前關(guān)于假激酶的來(lái)源有兩種不同的觀點(diǎn)，一是認(rèn)為假激酶是由活性激酶基因突變而成[4]；另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為活性激酶來(lái)自假激酶，最初這些假激酶主要行使其非催化功能，隨著基因的復(fù)制、突變，其中某些基因逐漸具備催化活性，形成真正的激酶[5]。從假激酶來(lái)源可看出與激酶聯(lián)系緊密。弓形蟲(chóng)假激酶的研究主要集中于棒狀體分泌的假激酶，其結(jié)構(gòu)由N端結(jié)構(gòu)域（NTE）和核心結(jié)構(gòu)域組成。N端結(jié)構(gòu)域保守性低、柔性強(qiáng)，由數(shù)個(gè)富含堿性氨基酸的α螺旋構(gòu)成，稱為N端延伸序列（NTE）。在某些假激酶（如ROP2）的晶體結(jié)構(gòu)中，NTE纏繞在激酶折疊結(jié)構(gòu)域的表面，充當(dāng)假激酶行使非磷酸化功能的作用亞基[6]。激酶的核心結(jié)構(gòu)域由12個(gè)亞結(jié)構(gòu)域（分別命名為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵa，Ⅵb，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ，Ⅺ ）組成，包括ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域、γ磷酸基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域、Mg2＋離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域等。假激酶與激酶的核心結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)分析（圖1）揭示弓形蟲(chóng)棒狀體假激酶成員在某些關(guān)鍵位點(diǎn)發(fā)生了不同程度的突變，如ROP2缺少結(jié)合ATPαβ磷酸基的富G環(huán)，Ⅱ亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)賴氨酸（K72）突變?yōu)榻M氨酸（H），Ⅶ亞結(jié)構(gòu)域中參與結(jié)合Mg2＋的3個(gè)催化殘基DFG中的天冬氨酸（D184）突變?yōu)楦拾彼幔℅），這些關(guān)鍵位點(diǎn)的突變，使ROP2不能與ATP結(jié)合（如圖2），喪失了蛋白激酶活性。同樣屬于假激酶的ROP4，ROP5，ROP7和ROP8的關(guān)鍵催化位點(diǎn)的突變情況與之相似，其亞結(jié)構(gòu)域（富G環(huán)、Ⅱ、Ⅶ）內(nèi)缺少一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基[7－9]，導(dǎo)致不能或錯(cuò)誤的與 ATP結(jié)合（如圖2），不具備激酶活性。這種結(jié)構(gòu)改變本質(zhì)上是一種趨利進(jìn)化方式，利于充分發(fā)揮假激酶的功能[10－11]。這些核心結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及不能使底物磷酸化的功能特性是目前區(qū)分及定義假激酶的唯一標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 假激酶與活性激酶核心結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵氨基酸殘基的比較分析Fig.1 Comparison of key amino acid residues of kinases and pseudokinases core domain

2 假激酶的作用機(jī)制

圖2 假激酶與PKA激酶結(jié)合ATP結(jié)構(gòu)示意圖（Kornev AP，Tavlor SS.Structure，2009）Fig.2 Binding ATP structure of pseudokinases and PKA kinase（Kornev AP，Tavlor SS.Structure，2009）

假激酶雖無(wú)激酶活性，但在生物進(jìn)化中，其基因一直保持編碼活性，且序列高度保守，說(shuō)明其編碼產(chǎn)物－假激酶具備重要的生理功能。目前已知假激酶的作用方式有3種：（1）通過(guò)構(gòu)象變化調(diào)控激酶活性；（2）作為支架蛋白為其它蛋白間的互相作用提供平臺(tái)；（3）與受體共同發(fā)揮作用，促進(jìn)細(xì)胞間的交流，或起到“保鏢”的作用，幫助其它蛋白準(zhǔn)確到達(dá)作用位點(diǎn)等。為揭示假激酶的作用機(jī)制，Elton Zeqiraj[12]等 研 究 了 三 元 復(fù) 合 物 LKB1－STRADMO25的晶體結(jié)構(gòu)，其中LKB1是調(diào)控腺苷酸激酶（AMPK）活性的腫瘤抑制蛋白激酶，STRADα是假激酶，MO25α為支架蛋白。STRADα采用一種類似于典型的蛋白激酶構(gòu)象（假的活性位點(diǎn)）結(jié)合LKB1為假底物，改變LKB1的構(gòu)象，促進(jìn)其活性構(gòu)象形成，同時(shí)MO25α通過(guò)與LKB1催化活性環(huán)的互作穩(wěn)定其活性構(gòu)象，使LKB1一直處于活性狀態(tài)。該研究揭示了假激酶STRADα通過(guò)自身構(gòu)象變化調(diào)控激酶LKB1活性的作用機(jī)制。Freeman[13]等研究表明假激酶iRhom可作為一種調(diào)控蛋白發(fā)揮作用，其成員iRhom2與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的TACE結(jié)合，使其離開(kāi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到達(dá)細(xì)胞膜，促進(jìn)抗炎因子TNFα的釋放，參與調(diào)控抗病原體的免疫保護(hù)反應(yīng)。Ras激酶抑制劑（KSR）是一種假激酶，其成員包括KRS1和KRS2，是 MAP激酶信號(hào)通路中Ras誘導(dǎo)RAFMEK－ERK組件活性的必需成員。Raf，MEK，ERK蛋白形成一個(gè)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，該通路與癌癥發(fā)生有關(guān)，在癌癥患者體內(nèi)被異常激活，KSR作為一種分子支架將RAF、MEK和ERK三成員綁定在一起。在芽殖酵母內(nèi)采用替換的方式研究了KSR1的作用機(jī)制。KSR1的假激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合MEK和RAF形成信號(hào)復(fù)合物，ERK通過(guò)一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的N端與假激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成三元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物。KSR2在MAP激酶信號(hào)通路中的支架功能與KSR1相似，并且被Ca2＋水平影響的去磷酸化作用調(diào)控[14－15]。假激酶無(wú)論哪種作用機(jī)制均與活性激酶的催化功能存在密切的聯(lián)系，為活性激酶的功能伴侶。

3 弓形蟲(chóng)棒狀體假激酶的功能

ROPKs家族中大量假激酶的存在，預(yù)示它們具有重要的功能，但目前多數(shù)假激酶的功能未知。ROP5由于缺少一個(gè)關(guān)鍵的催化殘基（天冬氨酸）導(dǎo)致其錯(cuò)誤的綁定ATP，不具備催化活性，屬于假激酶[16]。目前有關(guān)它的研究比較深入，具多態(tài)性，決定弓形蟲(chóng)不同基因型的致病力[17]。ROP5被分泌后通過(guò)膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RAH）定位于PVM。在小鼠體內(nèi)，ROP5通過(guò)阻止免疫相關(guān)GTP酶（IRGs）在PVM的積累維持PVM的完整性，逃避宿主細(xì)胞經(jīng)干擾素γ（IFNγ）調(diào)控的蟲(chóng)體清除機(jī)制。目前關(guān)于ROP5的作用機(jī)制有2種觀點(diǎn)，一是ROP5直接與IRGs互作，使IRGs的構(gòu)象發(fā)生變化，易于ROP18對(duì)其進(jìn)行磷酸化，導(dǎo)致IRGs失活，不能形成二聚體，影響它們?cè)赑VM上的積累。Boothroyd等的研究揭示，在小鼠體內(nèi)，ROP5能夠綁定IRGs家族的3個(gè)成員（IRGa6，IRGb6，IRGb10）。ROP5與IRGa6的互作占據(jù)掩蓋了IRGa6的活性位點(diǎn)，使IRGa6處于GDP－lock構(gòu)象狀態(tài)，該構(gòu)象不適于IRGa6在PVM聚集；且IRGa6核苷酸轉(zhuǎn)換環(huán)loopⅠ內(nèi)的兩個(gè)關(guān)鍵蘇氨酸（T102，T108）暴露在易被ROP18磷酸化的位置，有利于ROP18對(duì)ROP5－IRGa6復(fù)合物磷酸化，磷酸化的IRGa6永久失活，不能與PVM結(jié)合，從而喪失了對(duì)宿主細(xì)胞的保護(hù)作用[18]。二是ROP5通過(guò)改變ROP18構(gòu)象調(diào)控它的激酶活性，為ROP18的變構(gòu)增活因子。弓形蟲(chóng)強(qiáng)毒Ⅰ型遺傳圖譜顯示ROP5與ROP18可相互作用控制弓形蟲(chóng)的毒性。Behnke等的研究表明ROP5通過(guò)構(gòu)象變化調(diào)控ROP18的激酶活性，但不影響ROP18的表達(dá)及PVM定位。為了驗(yàn)證這一功能，用體外重組ROP18及從野生型蟲(chóng)株（RHDku80）和ROP5缺失株（RHDku80Drop5）中獲得ROP18，分別對(duì)人工合成的dMBP和宿主細(xì)胞內(nèi)的IRGb6進(jìn)行磷酸化。結(jié)果表明，在缺失ROP5的情況下，重組及內(nèi)原的ROP18對(duì)dMBP及IRGb6進(jìn)行磷酸化的能力顯著降低；在ROP5存在情況下，重組ROP18的活性增加12倍，內(nèi)源ROP18的活性增加35倍，并且能夠使dMBP和IRGb6磷酸化。這一研究否定了這些蛋白（ROP5，ROP18，IRGb6）形成穩(wěn)定復(fù)合物、ROP5與IRGb6、ROP18與IRGb6是增強(qiáng)ROP18活性的原因；同時(shí)證明ROP18的催化活性受假激酶ROP5的調(diào)控[19－20]。上述 ROP5的功能均借助于ROP18的激酶活性。最近的研究表明，ROP5的作用底物除了IRGs和ROP18外，還有其它效應(yīng)因子，其毒性作用亦可獨(dú)立完成，因?yàn)槿笔OP5的Ⅰ型株的毒性減弱程度大于ROP18缺失的Ⅰ型株。至于ROP5其它的互作效應(yīng)因子及毒性作用機(jī)制有待進(jìn)一步的探討[19]。

ROP2與ROP5一樣定位于PVM，是弓形蟲(chóng)ROPKs家族中最早被發(fā)現(xiàn)的典型代表，早期研究表明ROP2是一種跨膜蛋白，參與PVM的形成，通過(guò)N端的信號(hào)序列招募宿主細(xì)胞的線粒體及高爾基體到PVM的周圍，在宿主細(xì)胞線粒體與納蟲(chóng)泡膜之間形成分子連接，參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸、代謝產(chǎn)物的排泄及蟲(chóng)體與宿主細(xì)胞的相互作用[21－22]；但最近隨著對(duì)它跨膜的拓補(bǔ)學(xué)結(jié)構(gòu)及晶體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)研究的深入，認(rèn)識(shí)到它的上述作用是次要的，在蟲(chóng)體入侵及胞內(nèi)復(fù)制中可能通過(guò)其它方式擔(dān)當(dāng)重要角色[25]，至于具體什么作用目前仍是未知。此外，Hooi Yee研究表明ROP2重組蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，可作為弓形蟲(chóng)病免疫診斷的標(biāo)志物[6]。ROP2的功能是否與ROP5一樣能夠調(diào)控其它蛋白激酶的活性、是否具有其它重要的作用底物等都有待進(jìn)一步的研究。

研究表明ROP8與ROP2關(guān)系密切。ROP8基因與ROP2基因串聯(lián)存在，它們核苷酸及編碼氨基酸的同源性分別為85%、75%。在功能方面，ROP8與ROP2一起參與PV的構(gòu)建及PVM與宿主細(xì)胞線粒體的連接[23]。2014年，Alaganan A 等揭示ROP8，ROP2，ROP18，GRA7在PVM 上形成一個(gè)大的蛋白復(fù)合物；但通過(guò)基因敲除技術(shù)證明，ROP8，ROP2并不參與調(diào)控ROP18的功能[24]。與ROP2一樣，ROP8的功能有待深入研究。

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