注射用鹽酸吉西他濱細菌內毒素方法驗證

王春玲等

[摘要] 目的 對注射用鹽酸吉西他濱的細菌內毒素檢查方法進行探討，建立其細菌內毒素檢查方法。 方法 按《中國藥典》2010版附錄Ⅺ E細菌內毒素檢查方法進行。 結果 在驗證條件下，注射用鹽酸吉西他濱可以采用稀釋方法排除干擾。 結論 可以采用此法對本品的細菌內毒素進行檢查。

[關鍵詞] 注射用鹽酸吉西他濱；細菌內毒素方法；驗證

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）01-123-03

鹽酸吉西他濱（gemcitabine hydrochloride）化學名2-脫氧-2，2-鹽酸二氟脫氧胞苷（β-異構體），是一種阿糖胞苷類似物，由美國禮來公司研發的核苷類抗代謝抗癌藥[1]。屬于新型抗嘧啶核苷酸代謝化療藥物，屬細胞周期特異性抗代謝類藥物，主要作用于DNA合成期的腫瘤細胞，即S期細胞。在一定條件下，可以阻止G1期向S期的進展；具有抗瘤譜廣、作用機制獨特、毒性反應低、與其他化療藥物無交叉耐藥且毒性反應無疊加等特點。在過去的臨床工作中，我們觀察到鹽酸吉西他濱是療效較好而毒副反應較少的化療藥物之一[2-3]。無菌檢查、細菌內毒素、微生物限度檢查是藥品安全性檢查的重要項目[4]，本品為凍干粉針按照中國藥典2010版附錄ⅠB[5]的要求，要進行細菌內毒素檢查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Ms3digital旋渦混合器，CJ-2F凈化工作臺，DK-600S電熱恒溫水槽，DMH-1電熱干燥箱。

1.1.2 試劑 鱟試劑1[規格0.06EU/mL（0.1mL/支），批號10090612]福州新北生化工業有限公司；鱟試劑2[規格0.06EU/mL（0.1mL/支），批號1102111]湛江安度斯生物有限公司；鱟試驗用水（50mL/支，批號10010515）福州新北生化工業有限公司；細菌內毒素工作標準品（規格180EU/支，批號150601-200965）中國藥品生物制品檢定所；pH調節劑（規格2mL/支，批號100904）福州新北生化工業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗準備 所有容器、用具都必須經過處理，去除外源性內毒素，玻璃儀器于250℃干烤至少1h，塑料用具須確證不干擾實驗結果；操作過程中避免微生物污染；初次使用的鱟試劑必須經過靈敏度復核[5]。參照鹽酸吉西他濱的細菌內毒素限值，注射用鹽酸吉西他濱（0.4g）的細菌內毒素限值定為：按吉西他濱計L≤0.03EU/mg。

1.2.2 鱟試劑靈敏度復核 按《中國藥典》2010版二部附錄Ⅺ E細菌內毒素檢查法規定，進行鱟試劑的標示靈敏度復核。兩批鱟試劑經用細菌內毒素工作標準品檢查λc與λ一致（應在0.5λ≤λc≤2λ范圍內），結果均符合規定。

1.2.3 注射用鹽酸吉西他濱細菌內毒素檢查干擾試驗[5]

1.2.3.1 干擾預試驗（鱟試劑：λ=0.06EU/mL） 取本品，加鱟試驗用水（BET水）進行供試品溶液（NPC）和供試品陽性對照溶液（PPC）的配制。（1）供試品溶液（NPC）配制：取三個批號的供試品，分別用用鱟試驗用水10mL充分振搖使溶解。制備成10、5.0、2.5、1.2、0.625mg/mL五個濃度，并用pH調節劑調節pH值至6～8。（2）細菌內毒素工作標準品溶液稀釋方法：用1mL的鱟試驗用水溶解1支細菌內毒素工作標準品，用旋渦混合器連續混合15min，成180EU/mL，用BET水稀釋成4λ、2λ，進行下一步稀釋前，至少混和30s。（3）供試品陽性對照溶液（PPC）的配制：配制的濃度同NPC，每個濃度中含2λ（0.125EU/mL）的細菌內毒素。制備成10mg/mL+2λ、5.0mg/mL+2λ、2.5mg/mL+2λ、1.25mg/mL+2λ、0.625mg/mL+2λ五個濃度。（4）試驗過程：取上述二個廠家的鱟試劑各64支，先分別加入0.1mL BET水溶解，再分別加入0.1mL供試品和供試品陽性各濃度稀釋液，混勻后，于（37±1）℃無振動保溫（60±2）min，同時設陰性和陽性對照，每個濃度平行做2管。

通過上表的結果表明，注射用鹽酸吉西他濱在吉西他濱濃度為5.0mg/mL以下時，對以上二個廠家的鱟試劑均未產生干擾作用。故含吉西他濱5.0mg/mL稀釋液為最大有效活性濃度。實驗濃度選擇含吉西他濱為2.5mg/mL的稀釋液。

1.2.3.2 供試品的干擾試驗 為進一步確證供試品溶液對0.06EU/mL的鱟試劑是否存在干擾作用，分別用BET水和供試品2.5mg/mL稀釋液進行實驗，將細菌內毒素工作標準品配制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ濃度的系列內毒素溶液。（1）供試品2.5mg/mL稀釋液的制備：取上述三個批號的供試品，分別用BET水稀釋成含吉西他濱2.5mg/mL的供試液。（2）試驗過程（鱟試劑：λ=0.06EU/mL）：用BET水與2.5mg/mL供試液分別將細菌內毒素工作標準品稀釋成0.125EU/mL、0.06EU/mL、0.03EU/mL、0.015EU/mL四個濃度，作為細菌內毒素標準品溶液和細菌內毒素供試品溶液。取上述二個廠家的鱟試劑各72支，每支分別用0.1mL BET水溶解，再加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ的細菌內毒素標準品溶液和細菌內毒素供試品溶液各0.1mL，每一濃度平行做4管，輕輕混勻。同時分別用0.1mL鱟試驗用水和供試品溶液做陰性對照，平行做兩管。垂直放入電熱恒溫水槽中，從放入開始準確記錄時間，在（37±1）℃無振動保溫（60±2）分鐘。試驗結果見表2。

通過上表的結果表明，2.5mg/mL供試品稀釋液3個批號的供試品的Et值均在0.5～2Es范圍之間，確認無干擾影響。當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，需重新進行干擾試驗[5]。

2 結果

檢測三批注射用鹽酸吉西他濱細菌內毒素，檢測結果均符合規定。

3 討論

在本試驗條件下，取三個批號的供試品，用BET水分別按上述方法配制成2.5mg/mL供試品稀釋液，然后用λ=0.06EU/mL的上述二個廠家的鱟試劑各16支實驗，供試品的Et值均在0.5Es～2Es范圍之間，確認無干擾影響。注射用鹽酸吉西他濱經過按細菌內毒素檢查法實驗后，確證了本品可以用稀釋方法排除干擾，用細菌內毒素檢查法（凝膠法）對供試品進行細菌內毒素的檢測結果準確可靠。

[參考文獻]

[1] 應榮，黃建，郭紅云.鹽酸吉西他濱原料合成工藝研究[J].精細化工中間體，2008，38（5）：34-36.

[2] 李留樹，王如良.非小細胞肺癌的治療進展[J].解放軍保健醫學雜志，2011，3：199-200.

[3] 陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學[M].北京：人民衛生出版社，2004：675-676.

[4] 許玉華，杜鵑，湯楊.藥品微生物污染檢測方法驗證的必要性[J].中國藥品標準，2005，6（4）：46.

[5] 國家藥典委員會編.中國藥典二部附錄[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：6，100-101.

（收稿日期：2013-10-09）

[摘要] 目的 對注射用鹽酸吉西他濱的細菌內毒素檢查方法進行探討，建立其細菌內毒素檢查方法。 方法 按《中國藥典》2010版附錄Ⅺ E細菌內毒素檢查方法進行。 結果 在驗證條件下，注射用鹽酸吉西他濱可以采用稀釋方法排除干擾。 結論 可以采用此法對本品的細菌內毒素進行檢查。

[關鍵詞] 注射用鹽酸吉西他濱；細菌內毒素方法；驗證

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）01-123-03

鹽酸吉西他濱（gemcitabine hydrochloride）化學名2-脫氧-2，2-鹽酸二氟脫氧胞苷（β-異構體），是一種阿糖胞苷類似物，由美國禮來公司研發的核苷類抗代謝抗癌藥[1]。屬于新型抗嘧啶核苷酸代謝化療藥物，屬細胞周期特異性抗代謝類藥物，主要作用于DNA合成期的腫瘤細胞，即S期細胞。在一定條件下，可以阻止G1期向S期的進展；具有抗瘤譜廣、作用機制獨特、毒性反應低、與其他化療藥物無交叉耐藥且毒性反應無疊加等特點。在過去的臨床工作中，我們觀察到鹽酸吉西他濱是療效較好而毒副反應較少的化療藥物之一[2-3]。無菌檢查、細菌內毒素、微生物限度檢查是藥品安全性檢查的重要項目[4]，本品為凍干粉針按照中國藥典2010版附錄ⅠB[5]的要求，要進行細菌內毒素檢查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Ms3digital旋渦混合器，CJ-2F凈化工作臺，DK-600S電熱恒溫水槽，DMH-1電熱干燥箱。

1.1.2 試劑 鱟試劑1[規格0.06EU/mL（0.1mL/支），批號10090612]福州新北生化工業有限公司；鱟試劑2[規格0.06EU/mL（0.1mL/支），批號1102111]湛江安度斯生物有限公司；鱟試驗用水（50mL/支，批號10010515）福州新北生化工業有限公司；細菌內毒素工作標準品（規格180EU/支，批號150601-200965）中國藥品生物制品檢定所；pH調節劑（規格2mL/支，批號100904）福州新北生化工業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗準備 所有容器、用具都必須經過處理，去除外源性內毒素，玻璃儀器于250℃干烤至少1h，塑料用具須確證不干擾實驗結果；操作過程中避免微生物污染；初次使用的鱟試劑必須經過靈敏度復核[5]。參照鹽酸吉西他濱的細菌內毒素限值，注射用鹽酸吉西他濱（0.4g）的細菌內毒素限值定為：按吉西他濱計L≤0.03EU/mg。

1.2.2 鱟試劑靈敏度復核 按《中國藥典》2010版二部附錄Ⅺ E細菌內毒素檢查法規定，進行鱟試劑的標示靈敏度復核。兩批鱟試劑經用細菌內毒素工作標準品檢查λc與λ一致（應在0.5λ≤λc≤2λ范圍內），結果均符合規定。

1.2.3 注射用鹽酸吉西他濱細菌內毒素檢查干擾試驗[5]

1.2.3.1 干擾預試驗（鱟試劑：λ=0.06EU/mL） 取本品，加鱟試驗用水（BET水）進行供試品溶液（NPC）和供試品陽性對照溶液（PPC）的配制。（1）供試品溶液（NPC）配制：取三個批號的供試品，分別用用鱟試驗用水10mL充分振搖使溶解。制備成10、5.0、2.5、1.2、0.625mg/mL五個濃度，并用pH調節劑調節pH值至6～8。（2）細菌內毒素工作標準品溶液稀釋方法：用1mL的鱟試驗用水溶解1支細菌內毒素工作標準品，用旋渦混合器連續混合15min，成180EU/mL，用BET水稀釋成4λ、2λ，進行下一步稀釋前，至少混和30s。（3）供試品陽性對照溶液（PPC）的配制：配制的濃度同NPC，每個濃度中含2λ（0.125EU/mL）的細菌內毒素。制備成10mg/mL+2λ、5.0mg/mL+2λ、2.5mg/mL+2λ、1.25mg/mL+2λ、0.625mg/mL+2λ五個濃度。（4）試驗過程：取上述二個廠家的鱟試劑各64支，先分別加入0.1mL BET水溶解，再分別加入0.1mL供試品和供試品陽性各濃度稀釋液，混勻后，于（37±1）℃無振動保溫（60±2）min，同時設陰性和陽性對照，每個濃度平行做2管。

通過上表的結果表明，注射用鹽酸吉西他濱在吉西他濱濃度為5.0mg/mL以下時，對以上二個廠家的鱟試劑均未產生干擾作用。故含吉西他濱5.0mg/mL稀釋液為最大有效活性濃度。實驗濃度選擇含吉西他濱為2.5mg/mL的稀釋液。

1.2.3.2 供試品的干擾試驗 為進一步確證供試品溶液對0.06EU/mL的鱟試劑是否存在干擾作用，分別用BET水和供試品2.5mg/mL稀釋液進行實驗，將細菌內毒素工作標準品配制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ濃度的系列內毒素溶液。（1）供試品2.5mg/mL稀釋液的制備：取上述三個批號的供試品，分別用BET水稀釋成含吉西他濱2.5mg/mL的供試液。（2）試驗過程（鱟試劑：λ=0.06EU/mL）：用BET水與2.5mg/mL供試液分別將細菌內毒素工作標準品稀釋成0.125EU/mL、0.06EU/mL、0.03EU/mL、0.015EU/mL四個濃度，作為細菌內毒素標準品溶液和細菌內毒素供試品溶液。取上述二個廠家的鱟試劑各72支，每支分別用0.1mL BET水溶解，再加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ的細菌內毒素標準品溶液和細菌內毒素供試品溶液各0.1mL，每一濃度平行做4管，輕輕混勻。同時分別用0.1mL鱟試驗用水和供試品溶液做陰性對照，平行做兩管。垂直放入電熱恒溫水槽中，從放入開始準確記錄時間，在（37±1）℃無振動保溫（60±2）分鐘。試驗結果見表2。

通過上表的結果表明，2.5mg/mL供試品稀釋液3個批號的供試品的Et值均在0.5～2Es范圍之間，確認無干擾影響。當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，需重新進行干擾試驗[5]。

2 結果

檢測三批注射用鹽酸吉西他濱細菌內毒素，檢測結果均符合規定。

3 討論

在本試驗條件下，取三個批號的供試品，用BET水分別按上述方法配制成2.5mg/mL供試品稀釋液，然后用λ=0.06EU/mL的上述二個廠家的鱟試劑各16支實驗，供試品的Et值均在0.5Es～2Es范圍之間，確認無干擾影響。注射用鹽酸吉西他濱經過按細菌內毒素檢查法實驗后，確證了本品可以用稀釋方法排除干擾，用細菌內毒素檢查法（凝膠法）對供試品進行細菌內毒素的檢測結果準確可靠。

[參考文獻]

[1] 應榮，黃建，郭紅云.鹽酸吉西他濱原料合成工藝研究[J].精細化工中間體，2008，38（5）：34-36.

[2] 李留樹，王如良.非小細胞肺癌的治療進展[J].解放軍保健醫學雜志，2011，3：199-200.

[3] 陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學[M].北京：人民衛生出版社，2004：675-676.

[4] 許玉華，杜鵑，湯楊.藥品微生物污染檢測方法驗證的必要性[J].中國藥品標準，2005，6（4）：46.

[5] 國家藥典委員會編.中國藥典二部附錄[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：6，100-101.

（收稿日期：2013-10-09）

[摘要] 目的 對注射用鹽酸吉西他濱的細菌內毒素檢查方法進行探討，建立其細菌內毒素檢查方法。 方法 按《中國藥典》2010版附錄Ⅺ E細菌內毒素檢查方法進行。 結果 在驗證條件下，注射用鹽酸吉西他濱可以采用稀釋方法排除干擾。 結論 可以采用此法對本品的細菌內毒素進行檢查。

[關鍵詞] 注射用鹽酸吉西他濱；細菌內毒素方法；驗證

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）01-123-03

鹽酸吉西他濱（gemcitabine hydrochloride）化學名2-脫氧-2，2-鹽酸二氟脫氧胞苷（β-異構體），是一種阿糖胞苷類似物，由美國禮來公司研發的核苷類抗代謝抗癌藥[1]。屬于新型抗嘧啶核苷酸代謝化療藥物，屬細胞周期特異性抗代謝類藥物，主要作用于DNA合成期的腫瘤細胞，即S期細胞。在一定條件下，可以阻止G1期向S期的進展；具有抗瘤譜廣、作用機制獨特、毒性反應低、與其他化療藥物無交叉耐藥且毒性反應無疊加等特點。在過去的臨床工作中，我們觀察到鹽酸吉西他濱是療效較好而毒副反應較少的化療藥物之一[2-3]。無菌檢查、細菌內毒素、微生物限度檢查是藥品安全性檢查的重要項目[4]，本品為凍干粉針按照中國藥典2010版附錄ⅠB[5]的要求，要進行細菌內毒素檢查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Ms3digital旋渦混合器，CJ-2F凈化工作臺，DK-600S電熱恒溫水槽，DMH-1電熱干燥箱。

1.1.2 試劑 鱟試劑1[規格0.06EU/mL（0.1mL/支），批號10090612]福州新北生化工業有限公司；鱟試劑2[規格0.06EU/mL（0.1mL/支），批號1102111]湛江安度斯生物有限公司；鱟試驗用水（50mL/支，批號10010515）福州新北生化工業有限公司；細菌內毒素工作標準品（規格180EU/支，批號150601-200965）中國藥品生物制品檢定所；pH調節劑（規格2mL/支，批號100904）福州新北生化工業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗準備 所有容器、用具都必須經過處理，去除外源性內毒素，玻璃儀器于250℃干烤至少1h，塑料用具須確證不干擾實驗結果；操作過程中避免微生物污染；初次使用的鱟試劑必須經過靈敏度復核[5]。參照鹽酸吉西他濱的細菌內毒素限值，注射用鹽酸吉西他濱（0.4g）的細菌內毒素限值定為：按吉西他濱計L≤0.03EU/mg。

1.2.2 鱟試劑靈敏度復核 按《中國藥典》2010版二部附錄Ⅺ E細菌內毒素檢查法規定，進行鱟試劑的標示靈敏度復核。兩批鱟試劑經用細菌內毒素工作標準品檢查λc與λ一致（應在0.5λ≤λc≤2λ范圍內），結果均符合規定。

1.2.3 注射用鹽酸吉西他濱細菌內毒素檢查干擾試驗[5]

1.2.3.1 干擾預試驗（鱟試劑：λ=0.06EU/mL） 取本品，加鱟試驗用水（BET水）進行供試品溶液（NPC）和供試品陽性對照溶液（PPC）的配制。（1）供試品溶液（NPC）配制：取三個批號的供試品，分別用用鱟試驗用水10mL充分振搖使溶解。制備成10、5.0、2.5、1.2、0.625mg/mL五個濃度，并用pH調節劑調節pH值至6～8。（2）細菌內毒素工作標準品溶液稀釋方法：用1mL的鱟試驗用水溶解1支細菌內毒素工作標準品，用旋渦混合器連續混合15min，成180EU/mL，用BET水稀釋成4λ、2λ，進行下一步稀釋前，至少混和30s。（3）供試品陽性對照溶液（PPC）的配制：配制的濃度同NPC，每個濃度中含2λ（0.125EU/mL）的細菌內毒素。制備成10mg/mL+2λ、5.0mg/mL+2λ、2.5mg/mL+2λ、1.25mg/mL+2λ、0.625mg/mL+2λ五個濃度。（4）試驗過程：取上述二個廠家的鱟試劑各64支，先分別加入0.1mL BET水溶解，再分別加入0.1mL供試品和供試品陽性各濃度稀釋液，混勻后，于（37±1）℃無振動保溫（60±2）min，同時設陰性和陽性對照，每個濃度平行做2管。

通過上表的結果表明，注射用鹽酸吉西他濱在吉西他濱濃度為5.0mg/mL以下時，對以上二個廠家的鱟試劑均未產生干擾作用。故含吉西他濱5.0mg/mL稀釋液為最大有效活性濃度。實驗濃度選擇含吉西他濱為2.5mg/mL的稀釋液。

1.2.3.2 供試品的干擾試驗 為進一步確證供試品溶液對0.06EU/mL的鱟試劑是否存在干擾作用，分別用BET水和供試品2.5mg/mL稀釋液進行實驗，將細菌內毒素工作標準品配制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ濃度的系列內毒素溶液。（1）供試品2.5mg/mL稀釋液的制備：取上述三個批號的供試品，分別用BET水稀釋成含吉西他濱2.5mg/mL的供試液。（2）試驗過程（鱟試劑：λ=0.06EU/mL）：用BET水與2.5mg/mL供試液分別將細菌內毒素工作標準品稀釋成0.125EU/mL、0.06EU/mL、0.03EU/mL、0.015EU/mL四個濃度，作為細菌內毒素標準品溶液和細菌內毒素供試品溶液。取上述二個廠家的鱟試劑各72支，每支分別用0.1mL BET水溶解，再加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ的細菌內毒素標準品溶液和細菌內毒素供試品溶液各0.1mL，每一濃度平行做4管，輕輕混勻。同時分別用0.1mL鱟試驗用水和供試品溶液做陰性對照，平行做兩管。垂直放入電熱恒溫水槽中，從放入開始準確記錄時間，在（37±1）℃無振動保溫（60±2）分鐘。試驗結果見表2。

通過上表的結果表明，2.5mg/mL供試品稀釋液3個批號的供試品的Et值均在0.5～2Es范圍之間，確認無干擾影響。當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，需重新進行干擾試驗[5]。

2 結果

檢測三批注射用鹽酸吉西他濱細菌內毒素，檢測結果均符合規定。

3 討論

在本試驗條件下，取三個批號的供試品，用BET水分別按上述方法配制成2.5mg/mL供試品稀釋液，然后用λ=0.06EU/mL的上述二個廠家的鱟試劑各16支實驗，供試品的Et值均在0.5Es～2Es范圍之間，確認無干擾影響。注射用鹽酸吉西他濱經過按細菌內毒素檢查法實驗后，確證了本品可以用稀釋方法排除干擾，用細菌內毒素檢查法（凝膠法）對供試品進行細菌內毒素的檢測結果準確可靠。

[參考文獻]

[1] 應榮，黃建，郭紅云.鹽酸吉西他濱原料合成工藝研究[J].精細化工中間體，2008，38（5）：34-36.

[2] 李留樹，王如良.非小細胞肺癌的治療進展[J].解放軍保健醫學雜志，2011，3：199-200.

[3] 陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學[M].北京：人民衛生出版社，2004：675-676.

[4] 許玉華，杜鵑，湯楊.藥品微生物污染檢測方法驗證的必要性[J].中國藥品標準，2005，6（4）：46.

[5] 國家藥典委員會編.中國藥典二部附錄[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：6，100-101.

（收稿日期：2013-10-09）