應用基因芯片技術研究非毒性結節性甲狀腺腫基因表達的初步研究

姚金科等

[摘要] 目的 篩查非毒性結節性甲狀腺腫（NTNG）相關基因，探討NTNG發生機制。 方法 分別抽提NTNG患者甲狀腺組織及正常甲狀腺組織總RNA，逆轉錄合成相應以Cy5和Cy3標記的探針與基因表達譜芯片進行雜交，掃描芯片熒光信號圖像，用對掃描圖像進行數字化處理和分析。利用實時熒光定量PCR技術對篩選出的部分表達差異明顯的基因進行驗證。 結果 篩選出表達差異明顯的基因48個，其中NTNG組中表達上調的基因36條，表達下調的基因12條。熒光定量PCR結果與基因芯片一致。 結論 NTNG患者甲狀腺組織與正常甲狀腺組織之間存在明顯的基因表達差異，為NTNG患者提供相當數量的與細胞外基質、細胞因子、受體信號轉細胞信號傳遞等相關的差異表達基因，為NTNG早期診斷和治療提供了線索。

[關鍵詞] 寡核苷酸序列分析；非毒性結節性甲狀腺腫；基因；差異表達

[中圖分類號] R581.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）01-27-04

非毒性結節性甲狀腺腫（nontoxic nodular goiter，NTNG）是一種常見的甲狀腺疾病，發病率可高達6%～7%。以女性多見。與正常的甲狀腺細胞相比，非毒性結節性甲狀腺腫的甲狀腺細胞在DNA、RNA水平上應有差異。利用這三方面的指標的差異，研究非毒性結節性甲狀腺腫表達存在差異的相關基因的變化，有助于闡明其發生發展的機制。現利用基因芯片技術，初步研究分析篩選NTNG患者甲狀腺組織及正常甲狀腺組織之間差異表達的基因。

1 材料與方法

1.1 材料

所有標本均取自增城市人民醫院2009年10月～2011年10月住院患者，年齡（38.3±8.3）歲。NTNG患者共10例（男4例，女6例）。正常對照10例取自無甲狀腺病變患者的正常甲狀腺組織（男7例，女3例）。均經病理確診。將手術切除甲狀腺標本立即凍存于液氮中。Trizol試劑盒（Invitrogen公司），BiostarH-I DNA芯片（上海聯合基因公司），ScanArray 3000掃描儀（General Scanning公司），實時熒光定量試劑盒（日本TaKaRa公司），5700型實時熒光定量PCR儀（美國PE公司）。

1.2 總RNA抽提

總RNA抽提將每位NTNG患者甲狀腺組織及正常甲狀腺組織樣本取100mg分別合并。總RNA提取按Trizol試劑盒操作指南進行。測定A260/A280，范圍在1.8～2.0。用瓊脂糖凝膠電泳（5.0V/cm，0.5h）檢測總RNA質量，28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的2倍以上。

1.3 基因芯片

BiostarH-I DNA芯片，購自上海聯合基因公司，該芯片共含基因1152條，其中1068條有效基因，48條管家基因， 20條內參基因，陰性對照及空白對照各8條，內容涉及細胞凋亡、原癌基因、受體信號轉導等方面。

1.4 探針制備

將NTNG甲狀腺組織和正常甲狀腺組織總RNA分別逆轉錄成cDNA后作為探針以備與基因芯片雜交。探針的合成：用Superscript II逆轉錄酶，以及標記Cy5和Cy3的dUTP將總RNA逆轉錄成cDNA（其中Cy5用于標記NTNG甲狀腺組織，Cy3標記正常甲狀腺組織）。乙醇沉淀后溶解在20μL 5×SSC和0.2%SDS雜交液中。

1.5 雜交及洗滌

將雜交探針和基因芯片分別在95℃水浴中變性5min，然后將探針加在芯片上，用蓋玻片封片；再置于雜交箱，60℃，雜交15～17h；然后揭開蓋玻片，最后分別用2×SSC和0.2%SDS，0.1×SSC和0.2%SDS，0.1×SSC 洗滌10min，室溫28℃晾干。

1.6 檢測與分析

用ScanArray 3000掃描儀對雜交及洗滌制備良好的芯片進行掃描，將所得Cy5/Cy3圖像，過濾背景噪聲后，再提取基因表達的熒光信號強度值。應用ImaGene3.0軟件分析Cy3、Cy5兩種熒光信號的強度和比值。提取預先選定的內參照基因的Cy3和Cy5的原始熒光信號，然后進行均衡和標準化處理修正，數據小于800的Cy3、Cy5信號均剔除。判斷基因差異表達的標準：（1）Cy3和Cy5信號值其中之一必須大于800；（2）Cy3和Cy5信號比值的自然對數的絕對值（Ratio） >0.69（基因表達變化在2倍以上）。

1.7 實時熒光定量

PCR檢測MMP-9、p27的表達：采用嵌合熒光檢測法，按照5700型實時熒光定量PCR儀及實時熒光定量試劑盒（日本TaKaRa公司）的操作說明進行。采用50μL 反應體系：SYBR Premix Ex TaqTM （2×）25μL；PCR Forward Primer 2 μL；PCR Reverse Primer 2μL；ROX Reference Dye（50×）1μL；模板cDNA 4μL；以去離子水補足50μL設置反應條件。主要步驟：（1）預變性：95℃，30sec，1循環；（2）PCR：95℃ 5sec，60℃ 20sec，共40個循環；（3）融解曲線分析：95℃ 0sec，65℃ 15sec，95℃ 0sec。每個標本均平行擴增5管，包括MMP-9、p27和β-actin。每次擴增均制作標準曲線，以MMP-9，p27和β-actin的CT比值作為其相對表達水平。

1.8 統計學處理

使用SPSS15.0統計軟件處理數據。采用成組設計兩樣本t檢驗比較NTNG甲狀腺組織和正常甲狀腺組織的MMP-9、p27相對表達，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 基因表達譜分析結果endprint

Cy3熒光信號和Cy5熒光信號分別標記正常甲狀腺組織和NTNG甲狀腺組織并分別以綠色和紅色表示，對于某一點的兩種疊加熒光信號，如果Cy3信號較強呈下調趨勢，該點多顯綠色；如果Cy5信號較強呈上調趨勢，該點多顯紅色；如果強度相似，即顯示黃色。通過基因表達譜比較發現正常甲狀腺組織和NTNG甲狀腺組織基因表達差異2倍以上共有48條，表達上調有36條，下調12 條。其中表達上調的有：MMP-9、 Akt、AnnexinⅡ、bcl-2、Bmi-1、CK19、c-met、c-myc、COx-2、CyclinD1、Ki67、Gal-3、HBME-1、HMGB1KISS-1、MMP-2、TIMP-1、MUC1、P13K、P53 、pAkt、RARβ、Ras、S100A4、Smac、t-PA、TSGF、TSHR、VEGF-C、β-catenin、雌激素受體a亞型（ERa）、多態性上皮粘蛋白（polymorphic epithelial mucin，PEM，又名MUC1）、分化抑制蛋白-1（Id-1）、高分子量角蛋白（34βe12）、唾液酸化路易斯-X（SLeX）；下調的有：p27、Rb、NIS、APC、Caspase-7、Fas、MLH1、P21WAF1、金屬蛋白酶抑制基因RECK、磷酸化eIF4E結合蛋白1（p-4EBP1）、真核細胞翻譯起始因子4E（eIF4E）、DAPK1。

2.2 FQ-PCR鑒定MMP-9、p27的表達

NTNG甲狀腺組織的MMP-9相對表達量和正常甲狀腺組織相比較，差異有統計學意義（P<0.05）；NTNG甲狀腺組織的p27相對表達量和正常甲狀腺組織相比較，差異有統計學意義（P<0.05）；NTNG甲狀腺組織的MMP-9基因表達水平高于正常甲狀腺組，NTNG甲狀腺組織的p27基因表達水平低于正常甲狀腺組，與基因芯片結果是一致，詳見表1。

3 討論

非毒性結節性甲狀腺腫是一種分布廣泛的世界性疾病，發病率可高達6%～7%[1-2]，以女性多見。NTNG伴發甲狀腺癌一向受到重視，其發生率可高達4.0%～17.0%[3]。盡管如此，NTNG中存在甲狀腺癌已是不爭的事實。研究者普遍認為，NTNG的致病機制與激素、生長因子和甲狀腺濾泡的功能異質性等因素有關。但這些研究多是從某一方面的，指標比較單一，具有一定的局限性。基因芯片（Gene chip）技術特點是高通量、高集成、微型化和自動化。目前基因芯片已被廣泛應用于腫瘤[4-10]、代謝[11-12]、藥物治療等領域的研究中，尤其在腫瘤研究中得到更為廣泛的應用，推動了腫瘤發生、發展的分子機制的研究，在甲狀腺癌中已有學者進行了初步研究[13-15]。本研究利用基因芯片研究發現，在NTNG與正常甲狀腺組織之間存在較多的表達差異明顯的基因。其中顯著差異表達基因共有48條，表達上調有36條，下調12 條。表達上調的有：MMP-9、 Akt、AnnexinⅡ、bcl-2、Bmi-1、CK19、c-met、c-myc、COx-2、CyclinD1、Ki67、Gal-3、HBME-1、HMGB1KISS-1、MMP-2、TIMP-1、MUC1、P13K、P53 、pAkt、RARβ、Ras、S100A4、Smac、t-PA、TSGF、TSHR、VEGF-C、β-catenin、雌激素受體a亞型（ERa）、多態性上皮黏蛋白（polymorphic epithelial mucin，PEM，又名MUC1） 、分化抑制蛋白-1（d-1）、高分子量角蛋白（34βe12）、唾液酸化路易斯-X（SLeX）；下調的有：p27、Rb、NIS、APC、Caspase-7、Fas、MLH1、P21WAF1、金屬蛋白酶抑制基因RECK、磷酸化eIF4E結合蛋白1（p-4EBP1）、真核細胞翻譯起始因子4E（eIF4E）、DAPK1。其中FQ-PCR鑒定MMP-9、p27的表達，與基因芯片結果是一致。目前MMP-9在NTNG研究中很少報道，多數的研究生發現其與腫瘤的侵襲轉移有關，亦有學者在良性組織的研究中發現MMP-9對良性病變有一定的作用。程青等[16]指出肺氣腫模型組MMP-9和TIMP-1的表達與正常對照組相比明顯增強，且MMP-9/TIMP-1比值失衡，結論MMP-9/TIMP-1失衡在肺氣腫形成中起重要作用。詹陽等[17]發現在正常甲狀腺組織、良性甲狀腺結節和甲狀腺乳頭狀癌中MMP-9 mRNA表達隨著細胞異型性的增加呈上調的趨勢。本組在NTNG中MMP-9亦為上調。從本組研究表明NTNG發生發展可能與細胞外基質、細胞因子、受體信號轉細胞信號傳遞等相關的差異表達基因有關。其發生與多種因素有關，但由于研究的樣本有限，需進一步擴大研究。雖然有的基因其差異表達的意義還不很清楚，但為深入研究NTNG的發生發展機制提供了有價值的線索，在尋找NTNG的發病基因及治療方面具有積極的意義。

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