HPLC法測定當歸藤中兒茶素的含量

盧森華等

[摘要] 目的 建立當歸藤中兒茶素的含量高效液相色譜法。方法 采用HPLC法進行測定，色譜柱為C18柱（5μm，4.6×250mm），流動相為甲醇-0.5%冰乙酸溶液（15︰85），檢測波長為280nm。結(jié)果 兒茶素進樣量在0.26～1.35?g之間與峰面積值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r=0.9997，平均回收率為98.26%，RSD為2.6%（n=6）。結(jié)論 所建立的含量測定方法可行，質(zhì)量可控，穩(wěn)定性良好。

[關(guān)鍵詞] 當歸藤；HPLC；兒茶素

[中圖分類號] R917 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）01-117-03

當歸藤為紫金牛科植物當歸藤（Embelia parviflora Wall. ex A .DC.）的干燥根與老莖，別名小花酸藤子、篩箕蔃、土當歸等。其味苦、澀，性溫，具有補血、活血、益精壯陽、強腰膝的功效，常用于治療血虛諸癥、月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、產(chǎn)后虛弱、腰腿酸痛、跌打骨折等癥[1-2]，在廣西少數(shù)民族地區(qū)常將其作當歸使用，故民間流傳有“誰人懂得篩箕蔃，不愁不生養(yǎng)”之說，說明該藥可治療不孕癥等[3]。當歸藤還有溫腎補血作用，廣西特產(chǎn)中成藥“桂龍藥膏”以該藥材為原料。有文獻報道[4]從該藥材的根莖乙醇提取物中分離得到4個結(jié)晶，其中3個鑒定為正三十烷酸乙酯、正三十烷酸及α-菠甾醇，另一個結(jié)晶初步分析為具側(cè)鏈的羥基苯醌類成分。現(xiàn)代藥理研究表明，兒茶素具有抗癌、抗氧化、抗誘變、抗糖尿病、抗菌消炎、抗衰老、降脂減肥等多種功能，并且其作為一種新型的天然抗氧化劑在食品領(lǐng)域中得到了廣泛應用[5]。目前，關(guān)于該藥材中兒茶素含量測定未見報道，本文建立了當歸藤中兒茶素的含量測定方法，為當歸藤的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜議（美國安捷倫公司）；BP211D電子分析天平（德國賽多利斯）；C18柱（Diamonsil-2，5μm，4.6×250mm迪馬公司）；LG-16W高速微量離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；SB2200-T超聲波清洗器（上海必能信公司）。

1.2 試藥

兒茶素對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號877-200001，供含量測定用）；水為超純水，甲醇、乙腈（Fisher；色譜純），冰乙酸（國藥集團化學試劑有限公司，色譜純）；提取用甲醇、乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[6]

色譜柱為C18柱（Diamonsil-2，5μm，4.6× 250mm，迪馬公司），流動相為甲醇-0.5%冰乙酸溶液（15︰85），流速為0.8mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為280nm，進樣量為5?L，理論塔板數(shù)以兒茶素峰計算應不低于5000，分離度應大于1.5。

2.2 對照品溶液制備

精密取干燥至恒重的兒茶素對照品，稱定重量為5.64mg，置25mL量瓶中，加適量甲醇超聲使溶解，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（每毫升含兒茶素0.225mg）。

2.3 供試品溶液制備

取當歸藤藥材粉末約1g，精密稱定，置于錐形瓶中，加入50%乙醇20mL，稱重，超聲提取1h，放冷，稱定重量，用50%乙醇補足損失的重量，濾過，取續(xù)濾液約2mL至離心管中，10000轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清液備用，即得。

2.4 測定方法

分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液各5μL，在上述色譜條件下，供試品中兒茶素色譜峰與對照品色譜峰保留時間一致，并與其他共存成分分離度大于1.5。色譜圖見圖1、2。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述兒茶素對照品溶液（0.225mg/mL）1、2、3、4、5、6μL進樣，測定峰面積，以進樣量（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，并作最小二乘法線性回歸，得回歸方程：y=1118x+4.663，r=0.9997。結(jié)果表明兒茶素對照品濃度在0.26～1.35?g之間與峰面積值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗

精密吸取兒茶素對照品溶液（0.225mg/mL）5?L，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，其平均峰面積值為1221.0，RSD為0.32%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

取同一批藥材粉末4份（產(chǎn)地：廣西金秀），每份1g，精密測定，按供試品制備方法制備，測定峰面積并計算兒茶素含量，平均值為0.152%，RSD為0.38%。表明本法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取一份上述供試品溶液，每次精密吸取5?L，分別于1，2，4，6，12，24h進樣，測定其峰面積值并計算兒茶素含量，兒茶素的平均峰含量為0.153%，RSD為0.65%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.9 加樣回收試驗

取已知含量的供試品6份（產(chǎn)地：廣西金秀），每份約0.5g（含量為0.148%），精密稱定，分別加入一定量的兒茶素對照品溶液，照供試品溶液制備方法處理并測定兒茶素含量，計算回收率，平均回收率為98.26%，RSD為2.6%。結(jié)果見表1。

2.10 樣品含量測定

分別取不同產(chǎn)地當歸藤藥材粉末各一份，每份約1g，精密稱定，按供試品制備方法處理，測定峰面積，計算兒茶素含量。結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 含測對象的選擇

大量研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素具有抗氧化、抗誘變、協(xié)同抗癌、抗心血管疾病、抗衰老、清除自由基和降脂減肥等多種生理功能，并在食品、化妝品領(lǐng)域中得到較廣泛應用。我們在當歸藤中發(fā)現(xiàn)含有可觀的兒茶素含量，可作為含測對象；同時在選定的幾種備選含測物質(zhì)中兒茶素易得，價格便宜。

3.2 方法選擇

管海波等[7]在對當歸藤化學成分的研究過程中，分離得到大量的兒茶素，并利用紫外分光光度法測定了當歸藤中兒茶素含量，但紫外分光光度法精密度低，所以本文用HPLC法測定兒茶素的含量。

3.3 色譜條件的選擇

照紫外-可見分光光度法，在200～800nm掃描，結(jié)果在280nm處有最大吸收，故選280nm為測定波長。分別比較甲醇-水（15∶85）、乙腈-水（15∶85）、甲醇-0.5%冰乙酸（15∶85、10∶90、20∶80）幾個系統(tǒng)，以甲醇-0.5%冰乙酸（15∶85）效果最好。分別設定20℃、25℃、30℃、35℃不同的柱溫進行比較，在30℃條件下，峰分離效果最好[8]。分別考察了0.8、0.9、1.0mL/min不同流速下的色譜圖，分離效果都很好，但以0.8mL/min測得的柱效最高，因此確定最佳流速為0.8mL/min。

3.4 提取方法選擇

分別采用索氏靜置、回流提取和超聲提取進行比較，超聲與回流提取效果差不多，考慮到用超聲比較簡單，故選超聲；另分別考察了相同取樣量以5%、30%、50%、70%、95%乙醇進行提取，50%乙醇提取效果較優(yōu)[9]；另對超聲提取時間進行比較，結(jié)果測得超聲提取1h后趨于穩(wěn)定，故選定提取時間為1h。

3.5 展望

兒茶素藥理作用廣泛，近幾年對兒茶素的藥理活性的研究越來越多，研究顯示兒茶素有多樣的生物活性，對多種疾病的預防與治療都有使用價值，此外兒茶素與其他抗癌藥聯(lián)合使用具有增效作用，作為抗癌輔助治療具有廣闊的前景[10]。然而兒茶素類成分復雜，自身具有易氧化、易降解的生物學特性，體內(nèi)與體外的研究結(jié)果并不完全一致，兒茶素類的手性研究及其體內(nèi)與金屬離子、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的相互作用可能是今后研究的重點。鑒于兒茶素類物質(zhì)具有良好的保健功能，各種兒茶素現(xiàn)已廣泛使用在食品、保健品中，但目前兒茶素類作為單獨藥物應用于臨床還有一定距離。我們相信隨著構(gòu)效關(guān)系、代謝動力學、作用機制等研究的深入，兒茶素類物質(zhì)的應用可得到進一步深化。

[參考文獻]

[1] 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標準（1990版）[S].南寧：廣西科學技術(shù)出版社，1992：44.

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[5] 于莎莎，丁陽平，羅賽，等.兒茶素衍生物合成及藥理作用研究進展[J].食品科學，2012，33（17）：318-326.

[6] 林俐莎，葛建，楊晶晶，等.高效液相色譜法測定茶葉中兒茶素含量[J].醫(yī)藥導報，2011，30（12）：1639-1641.

[7] 管海波，銀小玲，覃江克，等.紫外分光光度法測定當歸藤中兒茶素含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（18）：10854-10855.

[8] 付靜，江海，李新生.超高效液相色譜法測定綠茶中5種兒茶素[J].分析試驗室，2012，27（4）：69-74.

[9] 高治平，劉剛，劉玉玲，等.馬尾松松針兒茶素提取工藝研究[J].應用化學，2011，40（3）：420-424.

[10] 徐先祥.兒茶素的藥理作用研究綜述[J].鄭州輕工業(yè)學院學報（自然科學版），2012，27（4）：60-64.

（收稿日期：2013-08-03）

3.2 方法選擇

管海波等[7]在對當歸藤化學成分的研究過程中，分離得到大量的兒茶素，并利用紫外分光光度法測定了當歸藤中兒茶素含量，但紫外分光光度法精密度低，所以本文用HPLC法測定兒茶素的含量。

3.3 色譜條件的選擇

照紫外-可見分光光度法，在200～800nm掃描，結(jié)果在280nm處有最大吸收，故選280nm為測定波長。分別比較甲醇-水（15∶85）、乙腈-水（15∶85）、甲醇-0.5%冰乙酸（15∶85、10∶90、20∶80）幾個系統(tǒng)，以甲醇-0.5%冰乙酸（15∶85）效果最好。分別設定20℃、25℃、30℃、35℃不同的柱溫進行比較，在30℃條件下，峰分離效果最好[8]。分別考察了0.8、0.9、1.0mL/min不同流速下的色譜圖，分離效果都很好，但以0.8mL/min測得的柱效最高，因此確定最佳流速為0.8mL/min。

3.4 提取方法選擇

分別采用索氏靜置、回流提取和超聲提取進行比較，超聲與回流提取效果差不多，考慮到用超聲比較簡單，故選超聲；另分別考察了相同取樣量以5%、30%、50%、70%、95%乙醇進行提取，50%乙醇提取效果較優(yōu)[9]；另對超聲提取時間進行比較，結(jié)果測得超聲提取1h后趨于穩(wěn)定，故選定提取時間為1h。

3.5 展望

兒茶素藥理作用廣泛，近幾年對兒茶素的藥理活性的研究越來越多，研究顯示兒茶素有多樣的生物活性，對多種疾病的預防與治療都有使用價值，此外兒茶素與其他抗癌藥聯(lián)合使用具有增效作用，作為抗癌輔助治療具有廣闊的前景[10]。然而兒茶素類成分復雜，自身具有易氧化、易降解的生物學特性，體內(nèi)與體外的研究結(jié)果并不完全一致，兒茶素類的手性研究及其體內(nèi)與金屬離子、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的相互作用可能是今后研究的重點。鑒于兒茶素類物質(zhì)具有良好的保健功能，各種兒茶素現(xiàn)已廣泛使用在食品、保健品中，但目前兒茶素類作為單獨藥物應用于臨床還有一定距離。我們相信隨著構(gòu)效關(guān)系、代謝動力學、作用機制等研究的深入，兒茶素類物質(zhì)的應用可得到進一步深化。

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[8] 付靜，江海，李新生.超高效液相色譜法測定綠茶中5種兒茶素[J].分析試驗室，2012，27（4）：69-74.

[9] 高治平，劉剛，劉玉玲，等.馬尾松松針兒茶素提取工藝研究[J].應用化學，2011，40（3）：420-424.

[10] 徐先祥.兒茶素的藥理作用研究綜述[J].鄭州輕工業(yè)學院學報（自然科學版），2012，27（4）：60-64.

（收稿日期：2013-08-03）

3.2 方法選擇

管海波等[7]在對當歸藤化學成分的研究過程中，分離得到大量的兒茶素，并利用紫外分光光度法測定了當歸藤中兒茶素含量，但紫外分光光度法精密度低，所以本文用HPLC法測定兒茶素的含量。

3.3 色譜條件的選擇

照紫外-可見分光光度法，在200～800nm掃描，結(jié)果在280nm處有最大吸收，故選280nm為測定波長。分別比較甲醇-水（15∶85）、乙腈-水（15∶85）、甲醇-0.5%冰乙酸（15∶85、10∶90、20∶80）幾個系統(tǒng)，以甲醇-0.5%冰乙酸（15∶85）效果最好。分別設定20℃、25℃、30℃、35℃不同的柱溫進行比較，在30℃條件下，峰分離效果最好[8]。分別考察了0.8、0.9、1.0mL/min不同流速下的色譜圖，分離效果都很好，但以0.8mL/min測得的柱效最高，因此確定最佳流速為0.8mL/min。

3.4 提取方法選擇

分別采用索氏靜置、回流提取和超聲提取進行比較，超聲與回流提取效果差不多，考慮到用超聲比較簡單，故選超聲；另分別考察了相同取樣量以5%、30%、50%、70%、95%乙醇進行提取，50%乙醇提取效果較優(yōu)[9]；另對超聲提取時間進行比較，結(jié)果測得超聲提取1h后趨于穩(wěn)定，故選定提取時間為1h。

3.5 展望

兒茶素藥理作用廣泛，近幾年對兒茶素的藥理活性的研究越來越多，研究顯示兒茶素有多樣的生物活性，對多種疾病的預防與治療都有使用價值，此外兒茶素與其他抗癌藥聯(lián)合使用具有增效作用，作為抗癌輔助治療具有廣闊的前景[10]。然而兒茶素類成分復雜，自身具有易氧化、易降解的生物學特性，體內(nèi)與體外的研究結(jié)果并不完全一致，兒茶素類的手性研究及其體內(nèi)與金屬離子、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的相互作用可能是今后研究的重點。鑒于兒茶素類物質(zhì)具有良好的保健功能，各種兒茶素現(xiàn)已廣泛使用在食品、保健品中，但目前兒茶素類作為單獨藥物應用于臨床還有一定距離。我們相信隨著構(gòu)效關(guān)系、代謝動力學、作用機制等研究的深入，兒茶素類物質(zhì)的應用可得到進一步深化。

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[6] 林俐莎，葛建，楊晶晶，等.高效液相色譜法測定茶葉中兒茶素含量[J].醫(yī)藥導報，2011，30（12）：1639-1641.

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[8] 付靜，江海，李新生.超高效液相色譜法測定綠茶中5種兒茶素[J].分析試驗室，2012，27（4）：69-74.

[9] 高治平，劉剛，劉玉玲，等.馬尾松松針兒茶素提取工藝研究[J].應用化學，2011，40（3）：420-424.

[10] 徐先祥.兒茶素的藥理作用研究綜述[J].鄭州輕工業(yè)學院學報（自然科學版），2012，27（4）：60-64.

（收稿日期：2013-08-03）