人肝癌細胞系7402、7721及癌旁肝細胞7701在重組腺病毒-胸苷激酶/更昔洛韋系統作用前后差異蛋白檢測及CK18表達

朱艷培，李 寧，陶 瑩，王 玨，于 瑋，戴 潔*（.首都醫科大學臨床病理中心，北京 00069；.首都醫科大學附屬北京佑安醫院肝膽外科，北京 00069；.首都醫科大學附屬北京安貞醫院病理科，北京0009）

·論著·

人肝癌細胞系7402、7721及癌旁肝細胞7701在重組腺病毒-胸苷激酶/更昔洛韋系統作用前后差異蛋白檢測及CK18表達

朱艷培1，李 寧2，陶 瑩1，王 玨1，于 瑋3，戴 潔1*
（1.首都醫科大學臨床病理中心，北京 100069；2.首都醫科大學附屬北京佑安醫院肝膽外科，北京 100069；3.首都醫科大學附屬北京安貞醫院病理科，北京100029）

目的檢測重組腺病毒-胸苷激酶/更昔洛韋（adenovirus-thymidine kinase/gancyclovir,ADV-TK/GCV）系統作用前后人肝癌細胞株7402、7721及癌旁肝細胞7701差異蛋白表達，進一步闡明ADV-TK/GCV自殺基因系統作用機制。方法利用肽質量指紋圖譜和雙向電泳分析法檢測ADV-TK/GCV系統對人肝癌細胞7402、7721及癌旁肝細胞7701作用前后的差異蛋白；常規病理學技術蘇木精伊紅染色、電子顯微鏡技術觀察作用前后細胞病理形態學改變；免疫細胞化學方法檢測細胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）的表達部位、分布范圍及量的變化。結果7721及7701對ADV-TK/GCV系統作用不敏感，人肝癌細胞7402經自殺基因藥物作用后，多種蛋白表達呈現出差異性，差異點主要表現為與物質能量代謝相關的酶類及與細胞骨架相關的蛋白，7402細胞的CK18表達上調明顯。加藥組7402細胞死亡明顯，殘留細胞體積變大，胞漿疏松，空泡變性。電鏡觀察顯示加藥組細胞器水腫，變化明顯，微絲增多，且多分布于核周圍，凋亡現象明顯。7402免疫細胞化學染色顯示加藥組CK18的表達增強且向核周聚集。結論ADV-TK/GCV自殺基因系統作用后，敏感株7402蛋白表達具有差異性，其中CK18表達顯著上調且出現分布改變，并引起細胞形態學的變化。

肝腫瘤；差異蛋白；角蛋白質類

原發性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其因臨床發現晚，中晚期治療效果差而成為臨床上腫瘤治療的難點[1]。近年來生物治療已成為原發性肝癌的治療方法之一，基因治療已經顯示出了潛在的療效及良好的發展前景[2]。自殺基因又稱為前藥轉換酶基因，可以編碼特殊的酶，催化原先無毒、低毒的前藥形成有較高毒性的代謝產物，從而達到殺死腫瘤細胞的目的，并具有先轉染后治療、易控制的優點[3]，為了進一步闡明重組腺病毒-胸苷激酶/更昔洛韋（adenovirus-thymidinekinase/gancyclovir,ADV-TK/GCV）自殺基因治療系統的作用機制，我們通過從體外培養的腫瘤細胞株中提取蛋白[4]進行ADV-TK/GCV系統作用前后的差異性檢測，試圖尋找ADV-TK/GCV自殺基因治療系統的作用前后蛋白質組的差異性，為肝癌等腫瘤的自殺基因治療提供治療及效果評價的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料：選用高轉移、對基因治療敏感的Bel-7402作為實驗組，高轉移、對基因治療不敏感的SMMC-7721和癌旁肝細胞株QSG-7701為對照組，3株細胞購于北京協和醫科大學細胞庫。

細胞培養基DMEM購于Gibco公司；ADV-TK購于深圳市天達康基因工程有限公司；輔助用藥GCV購于湖北科益藥業；差異蛋白檢測試劑購于Sigma公司；一抗鼠抗人CK18、PV9002、山羊血清工作液及HE染色試劑購于北京中杉金橋有限公司；電鏡染色試劑購于中鏡科儀技術有限公司。

細胞培養箱購于SANYO公司；石蠟切片機和超薄切片機購于德國Leica公司；透射電鏡購于日本JEOL公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理：取7402、7721及7701三株細胞，設立實驗組7402（﹢），以ADV-TK和GCV分別處理，對照組7402（-）、7721（-）及7701（-）以等量PBS和GCV處理。以5×105細胞/瓶接種于25cm2細胞培養瓶中，加入含10% 胎牛血清的DMEM培養基5mL，對照組與實驗組各10瓶進行培養。12h后，換液，各組每瓶加入4.9mLDMEM，然后實驗組每瓶加入100μL基因制劑ADV-TK,濃度為5×1010/mL（經預實驗50%致死率確定），對照組加入等量PBS。溫箱孵育24h，所有細胞每瓶加入GCV25μL,濃度為2.5×10-4g/mL，使終濃度為1.25×10-6g/mL，48h后用細胞刮刮取細胞，凍存。

1.2.2 蛋白提取:取各組凍干細胞，每管中加入1×全細胞裂解液10μL,超聲粉碎（冰上進行），4℃離心機，12 000r/min離心5min，取上清液，利用BCA蛋白定量試劑盒的微量測試法，制作標準曲線，測定蛋白濃度。

1.2.3 雙向電泳實驗:將提出的各組蛋白經固相pH梯度等電聚焦，平衡、垂直平板電泳，考馬斯亮藍染色及采集與分析蛋白圖象。1.0mg細胞總蛋白與重泡漲液（8mol/L尿素,2% 3-[3-（膽酰氨丙基）二甲氨基]丙碘酸丙鹽，0.5%固化電解質梯度（immobilineTMDrystrip，IPG）緩沖液1.75L,20mmol/L二硫蘇糖醇7L,痕量溴酚藍）混合并加入IPG膠槽中，覆蓋油覆蓋IPG膠條，置于固相pH梯度等電聚焦儀中聚焦；然后用含十二烷基磺酸鈉的平衡液平衡；將平衡好的IPG膠條轉移至13%聚丙烯酰胺均膠質中進行垂直平板電泳，20mA/膠電泳40min后換用30mA/膠，直至溴酚藍前沿抵玻璃板下緣；最后進行考馬斯亮藍染色及采集與分析蛋白圖象。

1.2.4 肽質量指紋圖譜鑒定蛋白質的差異性:將電泳后凝膠中蛋白點切出后，放入含50%乙腈、25mmol/LNH4HCO3的溶液，渦旋混合器振蕩約30min脫色，真空離心干燥，在干燥好的膠塊上加入胰蛋白酶酶液（0.01g/L，在25mmol/LNH4HCO3溶液內）進行切割，4℃放置15min使酶液完全被吸收，另補加25mmol/LNH4HCO3溶液保濕，37℃溫浴18～20h，收集酶切后的上清進行肽段提取后，使用布魯克道爾頓公司的AB4700 的MALDI-TOF/TOF-MS進行PMF圖象收集及在線檢索。儀器設置20kV，正離子，基質用α-氰基-4羥基肉桂酸，內標按照胰蛋白酶自切峰2163.05為校正標準，外標為7種標準肽段的混合物。

1.2.5 7402細胞HE染色:細胞爬片，3×104/孔接種于24孔板，每孔加入500μL完全DMEM培養基，12h后，換液，實驗組每孔加入400mLDMEM，100μL基因制劑ADV-TK,濃度為1×109/mL，對照組加入等量PBS。溫箱孵育24h，每瓶加入GCV125μL,濃度為1.25×10-6g/mL，48h后,4%多聚甲醛固定30min。蘇木精-伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

1.2.6CK18免疫細胞化學染色:細胞爬片，加藥，固定2h后，3%H2O2孵育15min,正常山羊血清封閉,滴加一抗濃度1∶200,4 ℃孵育過夜;加二抗工作液,DAB鏡下顯色;蘇木精復染,酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。

1.2.7 透射電鏡觀察:細胞用PBS清洗，離心成 1 小塊，3%戊二醛固定4h，脫水，包埋，聚合，超薄切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察。

2 結 果

2.1 差異蛋白檢測結果:肝癌細胞7721及癌旁肝細胞7701經自殺基因藥物作用后，細胞生長及形態學改變不明顯，蛋白表達無明顯差異。實驗組肝癌細胞7402處理后，多種蛋白表達呈現出差異性，在11個差異最為明顯的蛋白質組中，有6組明顯下調的差異點主要為與物質能量代謝相關的酶類，有5組明顯上調的差異點，其中有3組差異點與角蛋白相關。經比較分析CK18表達上調最為明顯（圖1，2）。

2.2 7402細胞HE染色細胞形態改變:實驗組細胞死亡明顯，殘留細胞體積變大，變圓，濃染，可見空泡變性，胞漿疏松（圖3A）；對照組細胞大多呈梭形，核仁明顯（圖3B）。

2.3 免疫細胞化學染色細胞形態改變:實驗組CK18的表達增強且分布不均，主要集中在核膜周圍胞質中，部分呈環狀分布（圖3C）；對照組CK18的表達在胞漿和胞膜均勻分布（圖3D）。

2.4 透射電鏡觀察細胞超微結構改變:細胞超微結構明顯變化，未加藥組胞漿內可見粗面內質網、滑面內質網、豐富的核糖體及大量溶酶體等細胞器結構，部分細胞內含脂滴，細胞表面絨毛明顯，偶見變性的線粒體、凋亡癌細胞。加藥組細胞變圓，細胞表面絨毛減少，大多數細胞器變性，可見空泡變性（圖4A），滑面內質網擴張，線粒體減少，溶酶體增多，胞漿內微絲結構增多，并多分布于細胞核周圍（圖4B）。部分細胞胞漿濃縮，電子密度增高，細胞器結構不清楚，核固縮，脂滴相對減少，并可見凋亡小體（圖4C）。

3 討 論

蛋白質組學是后基因組研究中最主要的部分，主要從兩個方面加以研究，一方面是“完全”蛋白質組學，目的是檢測一種細胞或一種組織內基因組表達的所有蛋白質，另一方面是“差異”蛋白質組學，目的是尋找和篩選任何有意義的因素引起的兩個樣本之間的差異蛋白質譜，同時對所獲得的某些蛋白進行功能分析及定性[5]。常用的蛋白質組學相關技術包括雙向電泳技術、生物質譜技術、生物信息學技術等[6]。有學者利用雙向凝膠電泳等蛋白質組學技術進行肝癌的蛋白分析，發現61個蛋白表達上調點，158個下調點，其中71個基因產物已得到證實，并首次發現在肝癌組織樣本中，熱激蛋白70、90和核糖核蛋白C1、C2的過表達，這些都為尋找肝癌的潛在蛋白標志物提供了依據[7]。目前，在肝癌生物治療的基礎和臨床研究中，基因治療已經顯示出了良好的發展前景，而自殺基因治療為主要采用的手段之一[8]。ADV-TK/GCV自殺基因系統又稱重組腺病毒介導胸昔激酶/更昔洛韋系統，ADV-TK編碼區共1 128個核苷酸，編碼的胸苷激酶為376氨基酸構成的蛋白產物，能催化GCV生成三磷酸更昔洛韋，在DNA復制時與脫氧三磷酸鳥苷競爭性的插入DNA，抑制腫瘤細胞DNA鏈的延伸，并且抑制DNA聚合酶活性，從而殺死腫瘤細胞[9]。但該系統影響腫瘤細胞生長代謝、運動等的相關機制和其所引起的基因及其蛋白質的表達變化報道并不多。

本研究利用肽質量指紋圖譜和雙向電泳分析法進行ADV-TK/GCV系統對人肝癌細胞7402、7721及癌旁肝細胞7701作用前后的差異蛋白檢測，共分析出40個有明顯差異的點，其中包括多種最有可能蛋白的上調與下調，對基因治療的敏感株7402而言，有11個點上調明顯，14個點下調明顯。差異點主要集中在與物質能量代謝的酶類相關的蛋白質組和與細胞骨架相關的蛋白質組。如下調差異蛋白點所覆蓋的蛋白質組可能包括丙酮酸激酶、磷酸甘油酸變位酶及谷胱甘肽S-轉移酶等與腫瘤物質能量代謝相關的酶類。除了下調的與細胞物質能量代謝相關的酶類外，上調的細胞骨架成分中，最有可能相對分子質量的蛋白以角蛋白為主要代表，本研究重點觀察了CK18的表達特點。

本研究結果顯示,CK18在對照組癌旁肝細胞株7701、對基因治療不敏感的肝癌細胞株7721及處理前的敏感株7402中均為少量表達，而ADV-TK/GCV處理后，只有敏感株7402檢測出CK18表達明顯增高。本研究結果提示敏感株7402的CK18表達增高與ADV-TK/GCV處理有關，關于CK18的功能，一般認為CK18屬于相對分子質量較小的Ⅰ型細胞角蛋白，作為細胞骨架蛋白中間微絲的一種，主要由腺上皮表達，目前被廣泛應用于腫瘤的診斷。正常肝臟組織即有CK18的表達，CK18被認為是成熟肝細胞的標志[10]。有學者[11]證實，正常肝組織與肝硬化組織中CK18表達率差異無統計學意義，而肝細胞癌組織CK18表達增高與肝硬化組織中CK18表達率差異有統計學意義。提示CK18參與了從肝硬化到肝細胞癌的癌變過程，認為它也是肝細胞癌的一個潛在的評價指標。

本研究結果表明,經ADV-TK/GCV處理后肝癌細胞形態明顯改變，細胞增大變圓，胞漿空泡變性，免疫細胞化學染色顯示CK18陽性表達物在未處理組為胞漿彌散分布，處理后陽性產物多聚集在核周。同時，電鏡下處理組細胞可見微絲在核周圍分布明顯增多，作為細胞骨架的微絲結構與細胞生長、運動等關系密切，因此ADV-TK/GCV自殺基因系統處理后CK18的表達及微絲分布的變化可能與肝癌細胞的生長代謝、運動及遷移有關。

同時，在細胞凋亡研究中發現，CK18被Casepase裂解于2個靶點（Asp238和Asp396），由此分解的片段在血液中的濃度穩定，且對細胞凋亡有高度的特異性[12]。凋亡通過內外兩條通路發生，最終通過各種酶的激活，從而降解細胞成分，其中就包括中間微絲網狀結構的水解斷裂及CK18的釋放入血，在肝細胞凋亡的過程中，CK18由于蛋白水解酶Caspase的作用釋放入血，因此被認為是肝細胞凋亡的指標[13]，目前臨床已利用CK18的血清學檢測觀察治療效果。本研究發現,ADV-TK/GCV處理后肝癌細胞7402的CK18表達上調及分布改變的同時，電鏡下可見凋亡小體增多。

本研究從蛋白質水平證實了ADV-TK/GCV自殺基因系統作用前后肝癌細胞7402在物質能量代謝類蛋白及細胞骨架類蛋白表達上出現明顯差異，并從病理形態學水平加以驗證，但這種差異是通過何種途徑實現的還需繼續深入研究。（本文圖見封二）

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（本文編輯：趙麗潔）

DETECTIONOFDIFFERENCEPROTEINANDOBSERVATIONOFPATHOMORPHISMONHUMANHEPATOMACARCINOMACELLLINE7402,7721ANDADJACENTLIVERCELL7701BEFOREANDAFTERADV-TK/GCVTREATMENT

ZHUYanpei1,LINing2,TAOYing1,WANGJue1,YUWei3,DAIJie1*
（1.CenterforClinicalPathology,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,BeijingYou’anHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China；3.DepartmentofPathology,BeijingAnzhenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100029,China）

ObjectiveTodetectetheexpressionofthedifferenceproteinsofthehumanhepatomacarcinomacellline7402，7721andadjacentlivercell7701beforeandafterthetreatmentoftheadenovirus-thymidinekinase/gancyclovir（ADV-TK/GCV）system,furtherelucidatingthemechanismofthesuicidegenesystemADV-TK/GCVonhepatomacells.MethodsPeptidemassfingerprinting（PMF）andtwo-dimensionalelectrophoresisanalysiswereusedtotesttheexpressionofthedifferenceproteinsofthehumanhepatomacelllines7402,7721andtheadjacentlivercellline7701beforeandafterthetreatmentoftheADV-TK/GCVsystem;moreover,weobservedthecellpathologicalmorphologychangesafterthetreatmentwithHemateinEosin（HE）,oneoftheroutinemethodsofpathology.Wealsousedtheelectron-microscopytodetecttheexpressionport,distributionandquantityofcytokeratin18 （CK18）ofdosinggroupandcontrolgroupwithimmunohistochemistry.Results7721and7701weresensitivetoADV-TK/GCVsystem.Theexpressionofmanyproteinsofthehumanhepatomacelllines7402,exhibiteddifferencesafterthedisposalmethodofsuicidegenedrugs,theexpressionofCK18wasupregulatedobviouslybycomparativeanalysis.CellularmorphologychangedsignificantlybyHE.Cellsinthecontrolgroupweremostlyspindle-shapedandnucleoliwereobvious,whilemostcellsindosinggroupdied.Thevolumeofresidualcellwassmall,round,andhyperchromatic.Electronmicroscopyobservationsshowedthatthecontrolabundantorganelles,accidentallysawcellapoptosis.Dosinggroupofcellorganellewereoedematousobviously,microfilamentincreasedandthroughoutaroundthenucleus,apoptosisphenomenonwasobvious.TheimmunocytochemistryshowedthattheexpressionofCK18ofthecontrolgroupwasequallydistributedinthecytoplasmandcellmembrane,buttheexpressionofCK18ofthetreatmentgroupincreasedandwasunevendistribution,mainlyconcentratedinthemembranesurroundingthecytoplasm,someofwhichwerecirculardistribution.ConclusionAfterthesuicidegenesystemADV-TK/GCVplayedarole,proteinexpressionofthesensitiveline7402showeddifferences,whichsuggestedtheexpressionofCK18upregulatedmemorably,thedistributionpresenteddifferencesandcausedchangesinthemorphology.

liverneoplasms;differentiallyexpressedproteins;keratins

2013-10-30；

2014-01-16

國家科技部傳染病防治重大專項（2008ZX10002-026）

朱艷培（1987-），女，云南楚雄人，首都醫科大學醫學碩士研究生，從事肝癌自殺基因治療研究。

R735.7

A

1007-3205（2014）05-0546-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.017

*通訊作者