生肌白玉膏對大鼠深II度燙傷創面EGF和VEGF表達的影響

王思農 張 博柳文紅 楊鵬斐

生肌白玉膏對大鼠深II度燙傷創面EGF和VEGF表達的影響

王思農 張 博?柳文紅 楊鵬斐

目的: 評價生肌白玉膏對大鼠深II度燙傷創面肉芽組織中表皮生長因子(EGF)和血管內皮生長因子(VEGF)的影響。方法: 80只深II度燙傷大鼠隨機分為生肌白玉膏組、美寶濕潤燒傷組，生理鹽水組和空白組，在第3、7、14、21天用免疫組化方法測定創面肉芽組織中EGF、VEGF陽性細胞變化。結果: 實驗組大鼠創面肉芽組織中EGF和VEGF陽性表達明顯高于其他組(P＜0.01)。結論:生肌白玉膏可能通過影響EGF和VEGF促進創面愈合。

生肌白玉膏； 創面； EGF； VEGF

生肌白玉膏為甘肅中醫學院附屬醫院院內制劑，主要作用是化腐生肌、消腫止痛、和血止血；主治燙(燒)傷、癰疽瘡毒和皮膚潰瘍久不收口等外科疾患。本實驗采用免疫組化方法測定各組創面肉芽組織中EGF、VEGF的表達，進一步明確生肌白玉膏促進大鼠深II度燙傷創面愈合的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級SD大鼠80只，雌雄各半，體重180±20 g，由甘肅中醫學院SPF實驗中心提供(實驗動物質量合格證許可證號:SCXK(甘)2011－0001，動物實驗設施使用證編號:SCXK(甘)2011－0001－0001333))。生肌白玉膏(甘肅中醫學院附屬醫院批號:20091020)，美寶濕潤燒傷膏(汕頭市美寶制藥有限公司，批準文號:國藥準字Z20000004，專利號:ZL 93100276.1；ZL 95116651.4)，生理鹽水(四川科倫藥業有限公司，2012.7.14，批號:N12071307－2 250 ml:2.25 mg)。實驗儀器:BI－2000醫學圖像分析系統(成都泰盟科技有限公司)，MiE圖像處理系統(山東易創電子有限公司)，OLYMPUS顯微鏡(日本，型號CX21型)。小鼠SP檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司批號:12127A11)，兔SP檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司批號:12122A11)，VEGF抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司批號: ZS－72690 lot:K2311)，EGF抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司批號:BS3549 lot NO:G22121)，陽離子防脫片(北京中杉金橋生物技術有限公司批號:ZLI－9506)，DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司批號:K1266071)。

1.2 方法

1.2.1 造模1造模前大鼠禁食12 h，自由飲水1天，用脫毛膏在大鼠背部脫毛，面積約3 cm×3 cm，清水洗凈，擦干。除空白組外，其余3組以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，其背部浸入直徑3 cm，溫度95℃的燒瓶中約10 s，造成大鼠深II度燙傷(經病理證實)。燙傷后3組均以林格氏液30 mL/kg腹腔注射，抗休克治療。

1.2.2 分組及給藥 造模成功后，將80只大鼠按照隨機數字表進行分組，空白組8只，實驗組、對照組及模型組各24只，分別涂抹生肌白玉膏1 g、美寶濕潤燒傷膏1 g及生理鹽水。每日1次，連續給藥至處死前1天，共3周。空白組不予任何處理，正常飼養。

1.2.3 取材 分別于造模后3、7、14、21天觀察記錄創面愈合情況，每個觀測點對6只大鼠取材，剪取大鼠背部創面肉芽組織約1 cm×1 cm，放入4%的甲醛中固定。待組織完全固定后石蠟包埋，切片用做免疫組化備用，每組6只大鼠創面肉芽組織均做免疫組化切片。

1.2.4 免疫組化SP法及步驟 (1)石蠟切片，常規脫蠟至水；(2)采用高壓熱修復，3.5%H2O2去離子水(無色液體)孵育15min，以消除內源性過氧化物酶活性，PBS沖洗，3 min×3次；(3)滴加正常山羊血清工作液室溫孵育15 min，傾去，勿洗；(4)滴加適當比例稀釋的一抗抗兔抗鼠EGF或VEGF，4℃過夜；(5) PBS沖洗，3min×3次；(6)滴加生物素化二抗山羊抗兔IgG抗體工作液，室溫或37℃孵育15min；(7)PBS沖洗，3 min×3次；(8)滴加生物素化二抗山羊抗小鼠IgG抗體工作液，室溫或37℃孵育15 min；(9)PBS沖洗，3 min×3次；(10)DAB顯色劑顯色5 min；(11)自來水充分沖洗；(12)選擇適當的封片劑封片。

1.2.5 結果判定標準 創面組織中EGF、VEGF陽性細胞的判斷，EGF在新生的肉芽組織中(成纖維細胞、血管內皮細胞及炎性細胞為主)表現為棕黃色、黃褐色顆粒狀物。VEGF在成纖維細胞、血管內皮細胞中表達明顯，呈棕黃色、黃褐色。光鏡下觀察細胞漿顏色，無特異性顏色表達者為陰性(－)，輕度表達為黃色(＋)，中度表達為棕色(＋＋)，明顯表達為深棕色(＋＋＋)。采用BI－2000醫學圖像分析系統及MiE圖像處理系統并攝片，結果以平均光密度表示，其值大小與平均光密度成正比。

1.2.6 統計學方法 數據采用ˉx±s表示，用SPSS 17.0統計軟件做單因素方差分析比較組間的差異是否具有統計學意義；P＜0.05表示差異有統計學意義，P＜0.01表示有顯著性差異。

2 結果

圖1 第7、14、21天創面肉芽組織中EGF的表達，a～c:實驗組；d～f:對照組；g～i:模型組(SP法，×200)

圖2 第7、14、21天創面肉芽組織中VEGF的表達，a～c:實驗組；d～f:對照組；g～i:模型組(SP法，×200)

2.1 創面組織中EGF、VEGF水平檢測 造模第3天時各組大鼠創面肉芽組織中EGF、VEGF的表達差異不明顯，在細胞漿中有少量淡黃色陽性細胞的表達但不均勻，陽性細胞核呈藍色顆粒狀表達。造模第7天時，模型組表現為(＋)，實驗組與對照組陽性表現為(＋＋)。造模第14天時，模型組表現為(＋＋)，實驗組與對照組表現為(＋＋＋)。造模第21天時，各組陽性細胞的表達均有所下降，模型組表現為(－～＋)，其它2組陽性細胞表現為(＋＋)但仍高于模型組。創面肉芽組織中第21天時對照組VEGF的表達較實驗組有所上升(圖1、2)。

2.2 大鼠創面愈合過程中各組肉芽組織EGF、VEGF比較 見表1、2。

表1 創面肉芽組織中EGF的表達

表2 創面肉芽組織中VEGF的表達

3 討論

生肌白玉膏由熟石膏、爐甘石、紫草、當歸、甘草、冰片、醫用白蠟等組成，實驗研究表明熟石膏中Ca2＋離子能抑制神經肌肉興奮性，減少血管通透性，故有抗炎、鎮靜、抗過敏、抗滲作用，可明顯減少創面滲液，改善創面血液循環。2爐甘石能夠改善創面的血液循環，加速創面的新陳代謝，促進傷口成纖維細胞和毛細血管的形成，加快肉芽組織增生，從而加速皮膚創口的愈合。3紫草的主要成分為紫草素，具有較好的抗菌、抗病毒、抗炎、抗過敏等作用，4在創面形成保護層，保持創面滋潤，刺激毛細血管再生和肉芽組織形成，并促進參與傷口愈合的生長因子的產生。5已有實驗研究表明當歸具有抗炎、清除氧自由基的作用，其提取物水劑型相關護膚品具有增加小鼠表皮含水量和提高小鼠皮膚細胞超氧化物歧化酶(SOD)活性的作用，6故對創面肉芽組織的生長也有一定的促進作用。甘草中所含的甘草黃酮能提高大鼠創面SOD酶活力使小鼠抗應激能力增強。7冰片具有明顯的抗炎、抗菌作用，可抑制或殺滅金黃色葡萄球菌、乙型溶菌性鏈球菌等5種常見細菌，對循環系統有一定的改善作用，可促進藥物經皮膚和黏膜的吸收，8提高藥物的利用率。以上藥物聯合運用，共具活血止痛散瘀，消腫生肌斂瘡的作用，使氣血運行通暢，肌膚得以濡養新生，達到治療的目的。實驗研究表明，重組人表皮生長因子(rhEGF)用于II度燒創面的治療可以加快創面愈合速度，明顯減少愈合時間，抑制創面瘢痕增生且無毒副作用，是一種安全有效的藥物。9VEGF可刺激和促進皮膚微血管內皮細胞相關因子的產生和活化，調控內皮細胞結構和功能，10進一步促進創面愈合。

本實驗中對創面肉芽組織中不同時間EGF、VEGF表達的檢測表明，生肌白玉膏在創面修復過程中能調節EGF、VEGF的表達，EGF可同時作用于成纖維細胞、血管內皮細胞、表皮細胞和成骨細胞等，具有化學趨化作用，是多種細胞的有絲分裂原，促進細胞由細胞周期NDA合成前期進入DNA合成期，VEGF是一種特異性作用于血管內皮細胞的多功能細胞因子，既能促使微血管內皮細胞增殖、遷移，又能增加微血管的通透性，使血液中的大分子物質進入細胞外基質中，形成纖維蛋白凝膠等，有利于新生血管和基質細胞生長。EGF、VEGF表達的升高能明顯促進成纖細胞生長，毛細血管新生，進而促進肉芽組織生長，促進創面的修復，因此生肌白玉膏促進燙(燒)傷創面愈合可能與其上調EGF、VEGF的表達具有一定的相關性。

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8陳艷紅，馮玉林.冰片的研究進展.中國社區醫師，2013，15 (6):10－11.

9鄧彪，李延輝.重組人表皮生長因子治療II度燒傷創面療效觀察.中國醫藥導刊，2012，14(9):1548－1549.

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(收稿:2013－10－22 修回:2013－12－13)

Effects of Shengjibaiyu ointment on the expression of EGF and VEGF in deep second degree scald wounds

WANG Si-nong，ZHANG Bo，LIU Wen-hong，et al.Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou，730000

Objective:To evaluate the effects of Shengjibaiyu ointment on the expression of epidermal growth factor(EGF)and vascular endothelial growth factor(VEGF)in granulation tissue of deep II degree scald wounds in rats.Methods:Eighty ratswere divided into Shengjibaiyu ointment group，MEBO group，saline group and blank group.EGF and VEGF were detected by immunohistochem icalmethod at day 3，7，14，21.Results:The expression of EGF and VEGF in experimental group was higher than those in other groups (P＜0.01).Conclusion:Shengjibaiyu ointmentmay promote the scald wound healing by influencing EGF and VEGF.

Shengjibaiyu ointment；wounds；EGF；VEGF

甘肅省中醫藥科研項目(編號:GZK－2012－19)

甘肅中醫學院，甘肅蘭州，730000

?通信作者