結(jié)核病免疫學(xué)標(biāo)記物研究進(jìn)展

章明徐 綜述，鄧少麗 審校

（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院檢驗(yàn)科 400042）

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌復(fù)合群（mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）引起的慢性感染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界結(jié)核病每年新增病例870萬(wàn)左右，其中，110萬(wàn)人合并HIV感染［1］。目前，主要依靠有效的疫苗、精確的診斷技術(shù)及合理的藥物治療等方法對(duì)結(jié)核病進(jìn)行有效的控制。然而，由于機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌（M.tuberculosis，MTB）免疫反應(yīng)的復(fù)雜性，致使目前為止對(duì)新型結(jié)核疫苗的評(píng)價(jià)、結(jié)核感染的診斷和感染后治療方案的調(diào)整等仍沒(méi)有確切的免疫學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)。因此，了解結(jié)核桿菌致病機(jī)制和宿主免疫反應(yīng)之間的相互作用，無(wú)疑將有助于找到合適的免疫學(xué)標(biāo)記物，以便明確感染各階段評(píng)價(jià)指標(biāo)。本文就結(jié)核桿菌感染不同階段其與宿主的關(guān)系及各類免疫學(xué)標(biāo)記物潛在應(yīng)用價(jià)值作一綜述，以期針對(duì)結(jié)核病的不同感染階段確定特有的免疫學(xué)標(biāo)記物，用以診斷結(jié)核病的病程和治療效果的評(píng)價(jià)。

1 免疫應(yīng)答在結(jié)核桿菌致病機(jī)制中的重要作用

結(jié)核桿菌感染人體后的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，且非一成不變。結(jié)核桿菌的致病作用與細(xì)菌在組織細(xì)胞內(nèi)頑強(qiáng)增殖引起炎性反應(yīng)，以及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)性損傷有關(guān)。人體首次感染結(jié)核桿菌后并不一定發(fā)病，宿主的免疫系統(tǒng)針對(duì)結(jié)核桿菌的固有免疫，以及引起的適應(yīng)性免疫可以有效控制結(jié)核桿菌的復(fù)制，造成潛伏感染；而當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)，結(jié)核菌在體內(nèi)擴(kuò)增造成繼發(fā)感染。由此可見，（1）結(jié)核桿菌的暴露不一定引起感染，提示結(jié)核桿菌有可能通過(guò)機(jī)體固有免疫應(yīng)答機(jī)制被清除，雖然這一機(jī)制目前尚未被證實(shí)；（2）感染結(jié)核桿菌后不一定引發(fā)結(jié)核病，這與機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答機(jī)制相關(guān)。

人體對(duì)結(jié)核桿菌的感染率很高，但發(fā)病率卻較低。研究發(fā)現(xiàn)，處于潛伏感染的患者只有不到10%的人會(huì)進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病，大多數(shù)潛伏感染患者體內(nèi)的結(jié)核桿菌可以逃避宿主的免疫系統(tǒng)監(jiān)測(cè)，而在宿主體內(nèi)存活長(zhǎng)達(dá)數(shù)年［2］。因此，結(jié)核桿菌致病機(jī)制與宿主免疫反應(yīng)之間的相互作用關(guān)系是機(jī)體感染結(jié)核桿菌后發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。

2 機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌免疫機(jī)制及其免疫學(xué)標(biāo)記物

2.1 固有免疫反應(yīng)機(jī)制 人體對(duì)結(jié)核桿菌的固有免疫主要包括被激活的巨噬細(xì)胞和致敏的T淋巴細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過(guò)受體介導(dǎo)方式識(shí)別并殺滅結(jié)核桿菌，亦可以通過(guò)自身凋亡來(lái)抑制結(jié)核桿菌進(jìn)一步生長(zhǎng)和繁殖。T細(xì)胞依據(jù)表面抗原識(shí)別受體類型分為αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞［3］。γδT細(xì)胞可分泌干擾素γ（IFN－γ）增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）產(chǎn)生白細(xì)胞介素－12（IL－12），使之有效的啟動(dòng)CD8＋T細(xì)胞應(yīng)答以對(duì)抗結(jié)核桿菌（MTB）。γδT 細(xì)胞亦可抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（transforming growth factor－beta，TGF－β）的產(chǎn)生，上調(diào)IFN－γ、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、IL－12等表達(dá)，有助于抑制結(jié)核桿菌生長(zhǎng)。

2.2 適應(yīng)性免疫反應(yīng)機(jī)制 適應(yīng)性免疫又稱特異性免疫，包括抗原呈遞，T細(xì)胞的識(shí)別、活化、應(yīng)答兩個(gè)階段?？乖蔬f細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）在吞入抗原后逐漸成熟，并高表達(dá)組織相融復(fù)合體－Ⅰ（MHC－Ⅰ）和MHC－Ⅱ分子，釋放大量IL－12誘導(dǎo)Th1細(xì)胞反應(yīng)［4］。T細(xì)胞依據(jù)表面抗原不同可分為CD4＋T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞，CD8＋T細(xì)胞可通過(guò)釋放胞質(zhì)顆粒酶和Fas／FasL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡殺滅病菌，亦可分泌IFN－γ活化巨噬細(xì)胞來(lái)清除結(jié)核桿菌。CD4＋Th細(xì)胞又可以分為Th0、Th1和 Th2 3種細(xì)胞。Th1細(xì)胞主要分泌IFN－γ、IL－2、TNF－β等細(xì)胞因子，正反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞主要分泌IL－4、IL－5、IL－10等細(xì)胞因子，輔助B細(xì)胞激活、增殖調(diào)節(jié)體液免疫。也有學(xué)者指出CD4＋T細(xì)胞還存在非IFN－γ依賴性機(jī)制來(lái)控制結(jié)核桿菌感染［5］。

3 機(jī)體免疫保護(hù)與發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及其免疫學(xué)標(biāo)記物

潛伏期感染患者體內(nèi)結(jié)核桿菌可以逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視，在體內(nèi)存活長(zhǎng)達(dá)數(shù)年而不發(fā)病，這可能與機(jī)體獲得結(jié)核免疫相關(guān)。這為我們研制更有效的結(jié)核疫苗提供了一個(gè)新的切入點(diǎn)。目前，常用的結(jié)核疫苗為卡介苗（bacillus calmette guerin，BCG），然而接種BCG后的免疫保護(hù)與機(jī)體感染結(jié)核后的免疫狀況很難區(qū)分［6］。有報(bào)道指出新生兒在接種卡介苗后，機(jī)體是否發(fā)病與CD4＋T細(xì)胞的免疫保護(hù)作用沒(méi)有太大關(guān)系［7］，同時(shí)有學(xué)者提出CD8＋T細(xì)胞在控制結(jié)核感染中發(fā)揮了重要作用［8］。由此可見，在抗結(jié)核免疫保護(hù)作用中，巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞、Th17細(xì)胞特別是結(jié)核特異Th1細(xì)胞［9］扮演了重要角色。常用的結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（tuberculin skin test reaction，TST）用于預(yù)測(cè)接種卡介苗后人群發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的能力有限［10］，因此，目前常選擇通過(guò)測(cè)量CD4＋T細(xì)胞特別是結(jié)核特異Th細(xì)胞分泌的IFN－γ、IL－2、TNF－β等細(xì)胞因子來(lái)區(qū)分BCG的免疫保護(hù)作用和結(jié)核感染。但是不同地區(qū)人群中這種生物標(biāo)記物也存在差異，因此此類指標(biāo)需考慮不同地區(qū)不同種族的適用性。

4 結(jié)核感染的診斷及其免疫學(xué)標(biāo)記物

結(jié)核感染的早期診斷可以有效的控制結(jié)核病的發(fā)展與傳播，然而目前的診斷技術(shù)還不能滿足臨床需求。在很多結(jié)核病嚴(yán)重流行的國(guó)家仍然依靠痰涂片方法來(lái)篩查結(jié)核病，此外肺外結(jié)核、痰涂片陰性結(jié)核，以及小兒結(jié)核為結(jié)核感染的早期診斷帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。

4.1 IFN－γ在診斷結(jié)核病中的價(jià)值 在過(guò)去很長(zhǎng)一段時(shí)間里，作者只能用TST來(lái)篩查結(jié)核病，遺憾的是TST還不能有效的區(qū)分結(jié)核桿菌感染和非典型結(jié)核感染。直到10年前γ干擾素釋放試驗(yàn)（interferon gamma release assays，IGRAs）的發(fā)明，為結(jié)核感染的診斷建立了新的標(biāo)準(zhǔn)［11］。IGRAs是利用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原［例如早期分泌抗原靶分子6（ESAT－6）、培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP－10）及TB7.7等］在體外刺激受檢者全血或外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），使T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量IFN－γ，然后檢測(cè)IFN－γ濃度或計(jì)數(shù)分泌IFN－γ細(xì)胞。通過(guò)ESAT－6和CFP－10測(cè)定機(jī)體IFN－γ可區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染和非典型分枝桿菌感染及BCG接種后的反應(yīng)性。此外，IGRAs在診斷潛伏性結(jié)核感染及預(yù)測(cè)結(jié)核發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)方面具有良好的應(yīng)用價(jià)值。由于潛伏性結(jié)核感染的診斷缺乏金標(biāo)準(zhǔn)，要想非常精確地衡量IGRAs在潛伏性結(jié)核感染診斷中的敏感性和特異性是很難做到的。因此，有人提出將IFN－γ定量將能更有效的區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染［11］。

此外，在活動(dòng)性結(jié)核和潛伏期結(jié)核感染患者體內(nèi)一些細(xì)胞因子［例如白細(xì)胞介素－8（IL－8）、轉(zhuǎn)錄因子 FOXP3以及IL－12β等］會(huì)表現(xiàn)出特有的變化趨勢(shì)［12］，這種特有的變化趨勢(shì)將有助于診斷結(jié)核的病程。目前，在活動(dòng)性結(jié)核病患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的僅分泌TNF的結(jié)核特異性CD4＋T細(xì)胞也將有助于區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏期結(jié)核感染［13］。

4.2 血清學(xué)診斷在結(jié)核病中的價(jià)值 結(jié)核感染的血清學(xué)診斷包括機(jī)體感染結(jié)核后抗體的檢查和結(jié)核特異性抗原的檢測(cè)，結(jié)核特異性抗原的檢測(cè)臨床應(yīng)用價(jià)值均高于抗體的檢測(cè)。然而血清學(xué)生物標(biāo)記物的應(yīng)用受限于結(jié)核特異性抗原的選擇和高效價(jià)特異性抗體的制備。也有學(xué)者提出多種結(jié)核特異性抗原的聯(lián)合應(yīng)用將有助于提高診斷的敏感性和特異性［14］。因此，針對(duì)多種結(jié)核特異性抗原的抗體譜系檢測(cè)結(jié)合宿主機(jī)體的免疫因子的譜系分析將有助于結(jié)核感染的診斷以及病程的判斷。

5 結(jié)核感染的治療及其免疫學(xué)標(biāo)記物

結(jié)核感染后治療方案的選擇及治療效果的評(píng)價(jià)目前尚沒(méi)有確切的免疫學(xué)指標(biāo)，因此利用宿主機(jī)體內(nèi)免疫學(xué)標(biāo)記物的變化情況，可有助于選擇合理的治療方案、評(píng)價(jià)治療效果和指導(dǎo)新型抗癆藥物的臨床試驗(yàn)。

5.1 治療前免疫學(xué)標(biāo)記物應(yīng)用價(jià)值 機(jī)體內(nèi)免疫學(xué)標(biāo)記物的變化情況可用于指導(dǎo)臨床的治療。在治療前，通過(guò)測(cè)定機(jī)體內(nèi)特定的免疫學(xué)標(biāo)記物含量以評(píng)價(jià)機(jī)體的免疫狀況，再根據(jù)機(jī)體免疫狀況選擇合適的治療方案；在治療中，免疫學(xué)標(biāo)記物的變化情況可直接反應(yīng)治療效果，以便隨時(shí)更改治療方案和預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)。以前常通過(guò)比較治療前后機(jī)體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量和X線片檢查變化情況來(lái)評(píng)價(jià)效果與預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，然而體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定耗時(shí)太長(zhǎng)，X線片檢查又缺乏明確的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［15］。因此，對(duì)于治療前后機(jī)體免疫狀況和治療效果的評(píng)價(jià)，免疫標(biāo)記物的研究起著不可替代的作用。

5.2 治療中免疫學(xué)標(biāo)記物應(yīng)用價(jià)值 目前，評(píng)價(jià)抗結(jié)核感染治療效果常依靠痰涂片或痰培養(yǎng)方法。由于這種評(píng)價(jià)模式是在接受治療2個(gè)月后才開始，這無(wú)疑耽誤了結(jié)核的有效治療期，特別是對(duì)于耐藥結(jié)核桿菌感染的患者。因此，通過(guò)測(cè)定機(jī)體特定免疫學(xué)標(biāo)記物的變化情況，既可直觀的反應(yīng)治療效果（例如機(jī)體對(duì)藥物的敏感性），又可預(yù)測(cè)疾病的轉(zhuǎn)歸。有研究報(bào)道，白細(xì)胞介素－10（IL－10）在治療有效的患者體內(nèi)表達(dá)下調(diào)，IFNγ／IL－10的值與治療有效相關(guān)且有助于區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏期結(jié)核感染［16］。同樣，IL－4和IL－4δ2在治療過(guò)程中表達(dá)有所上調(diào)，且IL－4／IL－4δ2有助于判斷疾病的預(yù)后［19］。

5.3 治療終點(diǎn)免疫學(xué)標(biāo)記物應(yīng)用價(jià)值 目前，很多抗結(jié)核藥物致力于縮短抗結(jié)核的治療周期，而結(jié)核病的復(fù)發(fā)率也無(wú)疑成為治療效果的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。因此，利用機(jī)體內(nèi)特定生物標(biāo)記物變化情況，評(píng)價(jià)治療結(jié)束后機(jī)體免疫狀況和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)日益重要。有研究報(bào)道，在治療結(jié)束后，機(jī)體內(nèi)僅分泌IFNγ的T細(xì)胞、既分泌IFNγ又分泌IL－2的 T細(xì)胞［18］，以及僅分泌 TNF的特異性T細(xì)胞數(shù)量均表現(xiàn)出特定的變化趨勢(shì)［19］。

6 展 望

結(jié)核桿菌因其頑強(qiáng)的生命力和復(fù)雜的免疫機(jī)制一直以來(lái)未能得到有效的控制，特別是近年來(lái)合并HIV感染的結(jié)核患者與非典型結(jié)核感染患者發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，使得結(jié)核病有死灰復(fù)燃的跡象。目前，結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)菌學(xué)檢查。然而痰涂片檢查陽(yáng)性率低，敏感性僅為34%～80%；痰培養(yǎng)需時(shí)又太長(zhǎng)，且由于設(shè)備限制不適合高發(fā)病率地區(qū)，因此，細(xì)菌學(xué)檢查對(duì)結(jié)核病的診斷價(jià)值有限。結(jié)核病的體液免疫學(xué)檢查和細(xì)胞免疫學(xué)檢查在臨床上也廣泛使用。例如基于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISPOT）技術(shù)的γ干擾素釋放試驗(yàn)（IGRAs），因其出色的敏感性和特異性使其不但成為最吸引人的免疫監(jiān)測(cè)候選方法之一，而且可以應(yīng)用于疫苗的研發(fā)、臨床診斷，以及基礎(chǔ)研究等多個(gè)方面。但依然無(wú)法確切的判斷結(jié)核的活動(dòng)性或潛伏期感染。因此，通過(guò)免疫學(xué)標(biāo)記物研究結(jié)核桿菌致病機(jī)制與宿主免疫反應(yīng)之間的相互作用關(guān)系，將成為控制結(jié)核感染的新突破口。生物信息學(xué)的快速發(fā)展也為新的生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。結(jié)核桿菌免疫學(xué)標(biāo)記物的研究不僅為結(jié)核桿菌的溯源、致病機(jī)制研究，以及耐藥性研究奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

本文中提及的一些免疫因子在結(jié)核病的不同階段呈現(xiàn)出特有的變化趨勢(shì)，但這些因子的作用和應(yīng)用價(jià)值還需要大量的臨床樣本研究，最終才能確定能否用于診斷結(jié)核病的病程和療效的評(píng)價(jià)。且一些免疫因子的變化情況與機(jī)體自身免疫狀況乃至地域性差異有一定聯(lián)系，因此，針對(duì)多種免疫因子的復(fù)合診斷方法將成為今后研究的方向。

［1］Gupta A，Kaul A，Tsolaki AG，et al.Mycobacterium tuberculosis：immune evasion，latency and reactivation［J］.Immunobiology，2012，217（3）：363－374.

［2］Pinheiro MB，Antonelli LR，Sathler－Avelar R，et al.CD4－CD8－αβandγδT cells display inflammatory and regulatory potentials during human tuberculosis［J］.PLoS One，2012，7（12）：e50923.

［3］Carvalho RV，Kleijn J，Meijer AH，et al.Modeling innate immune response to early Mycobacterium infection［J］.Comput Math Methods Med，2012，2012：790482.

［4］Rueda CM，Marín ND，García LF，et al.Characterization of CD4and CD8Tcells producing IFN－γin human latent and active tuberculosis［J］.Tuberculosis（Edinb），2010，90（6）：346－353.

［5］Rowland R，Mcshane H.Tuberculosis vaccines in clinical trials［J］.Expert Rev Vaccines，2011，10（5）：645－658.

［6］Kagina BM，Abel B，Scriba TJ，et al.Specific T cell frequency and cytokine expression profile do not correlate with protection against tuberculosis after bacillus Calmette－Guérin vaccination of newborns［J］.Am J Respir Crit Care Med，2010，182（8）：1073－1079.

［7］Rahman S，Magalhaes I，Rahman J，et al.Prime－boost vaccination with rBCG／rAd35enhances CD8？cytolytic T－cell responses in lesions from Mycobacterium tuberculosis－infected primates［J］.Mol Med，2012，18（1）：647－658.

［8］Heo DR，Shin SJ，Kim WS，et al.Mycobacterium tuberculosislpdC，Rv0462，induces dendritic cell maturation and Th1polarization［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，411（3）：642－647.

［9］Gran G，Amus J，Dyrhol－Riise AM.Screening for latent tuberculosis in Norwegian health care workers：high frequency of discordant tuberculin skin test positive and interferon－gamma release assay negative results［J］.BMC Public Health，2013，13（1）：353.

［10］Ferrara G，Losi M，F(xiàn)abbri LM，et al.Exploring the immune response against Mycobacterium tuberculosis for a better diagnosis of the infection［J］.Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2010，57（6）：425－433.

［11］Chiappini E，Accetta G，Bonsignori F，et al.Interferon－γ release assays for the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection in children：a systematic review and meta－analysis［J］.Int J Immunopathol Pharmacol，2012，25（3）：557－564.

［12］Chegou NN，Black GF，Kidd M，et al.Host markers in QuantiFERON supernatants differentiate active TB from latent TB infection：preliminary report［J］.BMC Pulm Med，2009，9（1）：21.

［13］Harari A，Rozot V，Enders FB，et al.Dominant TNF－α＋mycobacterium tuberculosis－specific CD4＋T cell responses discriminate between latent infection and active disease［J］.Nat Med，2011，17（3）：372－376.

［14］Koyama S.The diagnosis of pulmonary tuberculosis［J］.Rinsho Byori，2012，60（8）：796－803.

［15］Correale S RA，X－ray XL.D－transpeptidase LdtMt1from Mycobacterium tuberculosis［J］.Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun，2013，69（3）：253－256.

［16］Sai Priya VH，Latha GS，Hasnain SE，et al.Enhanced T cell responsiveness to Mycobacterium bovis BCG r32－kDa Ag correlates with successful anti－tuberculosis treatment in humans［J］.Cytokine，2010，52（3）：190－193.

［17］Wassie L，Demissie A，Aseffa A，et al.Ex vivo cytokine mRNA levels correlate with changing clinical status of ethiopian TB patients and their contacts over time［J］.PLoS One，2008，3（1）：e1522.

［18］Chiappini E，Della Bella C.Potential role of M tuberculosis specific IFN－γand IL－2ELISPOT assays in discriminating children with active or latent tuberculosis［J］.PLoS One，2012，7（9）：460－465.

［19］Kleinsteuber K，Heesch K，Schattling S，et al.Decreased expression of miR－21，miR－26a，miR－29a，and miR－142－3p in CD4＋T cells and peripheral blood from tuberculosis patients［J］.PLoS One，2013，8（4）：e61609.