適配體在體外細胞檢測中的應用＊

唐德平，張宇潔綜述，毛愛紅審校

（1.蘭州交通大學化學與生物工程學院，蘭州730070；2.甘肅省醫學科學研究院，蘭州730050）

抗體廣泛用于細胞檢測，其檢測歷史悠久，技術成熟，但抗體具有體內篩選周期長，成本高；對溫度敏感，易永久性變性，對檢測環境要求高等缺點，限制了抗體的應用范圍。適配體能與靶分子專一并緊密結合，是一種有前景的分子識別配基［1］。適配體作為分子識別配基，與抗體相比具有獨特的優勢：首先，適配體通過體外篩選，適用于非生理條件和（或）極端條件，篩選周期一般為2～3個月，最快只需2周，而抗體由體內產生，篩選周期至少為3～6個月；體外可以篩選到針對弱免疫原性或高毒性分子的適配體，而體內很難獲得相應的抗體；其次，適配體采用化學合成，產品批間差異極小，可被各種基團靈活修飾，使其具有多種功能；再次，適配體具有化學穩定性，可耐受苛刻條件，并具有一定的熱復性；最后，適配體組成簡單，分子量較小，免疫原性低［2－4］。適配體擁有抗體無法比擬的優勢，已被廣泛研究用于臨床檢測［5］。本文綜述了適配體在流式細胞分析、納米粒子細胞傳感器、微流體細胞分離和組織學檢查中的應用。

1 流式細胞分析

流式細胞儀能夠在幾秒鐘內分析上千個細胞，已被廣泛用于臨床診斷。在流式細胞分析之前，通常用帶有熒光的配基標記。適配體已被開發用于細胞標記和流式細胞分析［6－7］。Ringquist利用二價抗－L－選擇凝集素（anti－L－selectin）適配體標記淋巴細胞和中性白細胞，結果表明二價適配體在結合細胞L－選擇凝集素中展示出特異性和選擇性，其結合效應與抗－L－選擇凝集素抗體相似；二價適配體比單價適配體展示出更強的親和力，能改善流式細胞儀對靶細胞的檢測。因此，增加適配體的價數有望提高適配體的親和力和增加流式細胞分析的效率。Kim等［6］通過分子組裝合成出二價雜交適配體，但兩個相同或不同適配體長寡核苷酸序列的合成效率較低，且很難同時合成多個鏈以獲得超過二價的適配體。Zhou等［7］利用雜交適配體－樹突狀納米材料模仿抗體結構和功能，并研究其在流式細胞分析中的應用，結果表明：雜交適配體－樹突狀納米材料具有高親和力和高特異性，在流式細胞分析中有很大的應用潛能。該材料的合成分兩步進行：首先將適配體和樹突狀納米材料進行化學連接，然后將兩個適配體進行分子內雜交形成二價雜交適配體。適配體用于結合靶分子，而樹突狀納米材料用作載運熒光的位點。由于樹突狀納米材料是一種多價納米折疊物，理論上，單個樹突狀納米材料可連接多個適配體，從而可以實現多價適配體的制備。

腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSC）和循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）對腫瘤轉移診斷和治療效果評價具有重要意義，但CSC和CTC通常非常少，在早期癌癥患者每毫升血液中大約有5×109個正常細胞，而CTC通常少于100個［8－10］。在檢測前，靶細胞的富集是必不可少的。在富集過程中，一些細胞形成細胞簇，細胞簇的特征與單個細胞不同。流式細胞分析用于細胞檢測具有廣泛的應用前景，但利用流式細胞儀分析所有靶細胞仍是一種挑戰，需要進一步研究和改善。

2 納米粒子細胞傳感器

生物傳感器是利用分子識別元件和待測物的特異性結合產生的生物學信息，通過轉換器轉化為電、光等物理信號，從而實現分析檢測的目的［11］。其具有快速、靈敏、特異性高、成本低的優點。納米粒子比表面積大，具有優異的光學、電學和磁學性能，且能夠在表面進行功能化修飾，可以大大提高生物傳感器的靈敏度和穩定性，已被廣泛研究用于檢測和診斷［12－14］。

Tan等研究表明適配體功能化納米粒子可用于檢測各種細胞，其檢測方法主要有2種：（1）將適配體功能化的磁性納米粒子和熒光納米粒子混合，孵育在細胞懸液中。適配體功能化的磁性納米粒子具有細胞識別和細胞分離功能，可以快速將靶細胞從混合物中提取出來，適配體功能化的熒光納米粒子可用于細胞檢測，提高敏感性。因為生物標記分子通常在靶細胞表面過度表達，靶細胞表面有多個生物標記分子。因此，磁性納米粒子和熒光納米粒子可以結合到同一靶細胞上，而不必考慮兩種納米粒子在結合靶細胞時的競爭作用。利用這種方法，靶細胞可以從細胞混合物中分離和使用熒光成像、流式細胞儀和酶標儀等方法檢測。對同一樣本可進行連續分離和多細胞檢測，其檢測閾達到大約250個細胞／毫升血液。（2）應用適配體功能化金納米粒子。該方法基于金納米粒子的等離子共振。當金納米粒子相互接近時，其吸收光譜移動，包含金納米粒子系統的顏色就會發生變化，當金納米粒子被細胞特異的適配體功能化后，他們就可識別靶細胞、組裝在他們表面，形成一個類似大金顆粒的單元。就可用比色法檢測靶細胞，其檢測閾約為90個細胞／毫升血液，1 000個靶細胞可導致肉眼可見的顏色變化。該方法可將靶細胞從混合細胞中分離和檢測，其優點是靈敏度高，快速，不需要復雜的儀器。適配體功能化納米粒子具有檢測靶細胞的潛能，但當檢測系統中含顯色分子時如胎牛血清，影響檢測閾，檢測前應去除一些顯色物質。當被檢測靶細胞數量較少時，如CTC，該方法需進一步改善以提高檢測閾。

3 微流體細胞分離

微流體裝置具有比表面積大，能夠快速實現生物分子和細胞分離，已被廣泛研究用于生物傳感應用［15－16］。Toner等將抗體固定在微流體裝置的表面，用于從人血中分離極少的CTC，可一步從每毫升全血中捕獲5～1 281個CTC，而不需要預先標記、稀釋等操作，對癌癥的早期診斷和長期監測具有應用價值。但抗體－細胞相互反應較強，可啟動細胞間信號傳遞或導致細胞死亡，不利于捕獲細胞的復蘇。為了復蘇捕獲的細胞，生物芯片的表面包裹精氨酸－甘氨酸－天門冬氨酸（Arg－Gly－Asp，RGD）肽功能化的藻酸鹽，包被的藻酸鹽可被螯合劑分解，進而釋放捕獲細胞。盡管生物芯片包被藻酸鹽可以富集細胞，但其選擇性較差，未包被的芯片表面也有大量細胞被捕獲。

適配體功能化的微流體裝置已經被研究用于分離癌細胞［17－19］。適配體功能化的微流體裝置在不同的階段用不同的適配體功能化，可以同時富集多種細胞［17］。Sheng等［19］研究表明，在流速600nL／s下，白血病細胞的捕獲率達95%，純度達81%；從末處理的全血中分離色素瘤細胞，分離極限達到10個細胞／毫升血液，93%被捕獲的細胞具有生物學活性。Wan等［20］研究表明，在微流體裝置中，流速是影響分離效率的重要因素。適配體功能化的微流體裝置可用于細胞分離，與抗體功能化的微流體裝置相比，其分離極限相似，但更有利于捕獲細胞的復蘇。

Flores等［21］研究表明CTC比腫瘤細胞株更加脆弱。捕獲的CTC的活性和功能復蘇顯得更為重要。因此，在臨床實踐中需要發展一種非破壞的方法用于釋放捕獲的細胞。可采用可溶性配基或與細胞受體無關的配基與適配體競爭結合，用于釋放被捕獲的細胞。但當細胞與固定到同一材料上的多個適配體結合后，通過單價配基或受體競爭不易破壞細胞－適配體間的相互作用，導致捕獲的細胞不易被釋放。因為細胞－適配體間的多價作用強于配基－適配體間的單價作用。而一些在低溫下篩選的適配體在體溫時親和力明顯下降，這些溫度敏感型適配體可被開發用于微流體裝置，用來非破壞性捕獲細胞［22］。

4 組織學檢查

免疫組化分析常用于活檢樣本中生物標記物的檢查，組織切片中的生物標記物通過抗原－抗體反應被標記的抗體包被，然后應用熒光染料或生色酶（如辣根過氧化物酶）使結果可視。免疫組化分析中，抗體是主要試劑。適配體對靶分子具有高親和力，已被研究作為抗體替代分子用于組織學分析。

適配體可以被熒光標記，直接用于可視監測固體瘤中的生物標記物。Zhang等［23］篩選到可與促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）高親和力結合的適配體。該適配體已經被研究用于檢測EPO在人膀胱癌細胞系和人腫瘤尿道上皮組織中的表達。顯微圖像表明，與抗－EPO抗體相比，抗－EPO適配體在結合正常人尿道上皮組織時表現出較低的交叉反應。為提高生物標記物檢測的靈敏性，通常需要信號放大。傳統的免疫組化分析利用生色酶（如辣根過氧化物酶）氧化底物來放大信號。適配體可被放射性核素標記，避免使用多種檢測試劑。Thirstrup等［24］最近發明了一種新方法來放大信號，將適配體與具有催化活性的氯化血紅素化學連接，以二氨基聯苯胺（3，3′－diaminobenzidine）為底物來檢測其催化功能。該連接物比大多數抗體或酶小，易于化學合成，且比酶或抗體溫度適應范圍廣，可長期儲存。但其缺點是沒有生色酶敏感，需進一步提高其靈敏度。Sun等［25］將熒光標記的適配體通過雜交與金納米粒子結合，此時熒光淬滅，當適配體與靶標結合后，適配體與金納米粒子脫離，產生熒光，該法能夠降低本底反應，提高檢測靈敏度。

5 挑戰和前景

適配體用于體外細胞檢測已經獲得了很多鼓舞人心的成果，具有廣闊的應用前景。但開發適配體作為診斷工具仍面臨很多挑戰。（1）適配體的篩選。相比于種類繁多的抗體，針對不同細胞的適配體種類有限，這是限制適配體用于細胞檢測發展的瓶頸，發展更高效的篩選方法，提高適配體的親和力和特異性還需深入研究；很多適配體是在界定的條件下篩選出來的，適配體在其篩選的條件下對靶具親和力，而在不同于篩選條件下也許無功能。（2）多價適配體的合成。多價分子比單價分子對靶分子具更高的親和力，目前，可利用偶聯反應或非共價結合，通過化學連接2個或多個適配體來獲得多價適配體，但其合成效率較低，快速高效合成多價適配體的方法有待進一步研究。盡管存在這些挑戰，我們仍然相信在不久的將來，適配體在臨床診斷領域將得到廣泛應用。

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