鵝去氧膽酸與熊去氧膽酸的合成工藝研究

張 飛，趙靜國，趙蒙浩

(武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023)

鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)是動物體膽汁中的一種生化物質，臨床上不僅用作溶解膽固醇類結石和糾正飽和膽汁的藥物，還具有顯著的平喘、抗炎、鎮咳和祛痰作用，同時鵝去氧膽酸還是昂貴的熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)的合成原料[1]。熊去氧膽酸是名貴中藥熊膽中的主要有效成分，在臨床上用于治療各種膽石疾病及急慢性肝病，具有良好的效果[2]。

目前，制備鵝去氧膽酸與熊去氧膽酸主要有動物膽汁提取和人工合成兩種方法，但動物膽汁提取來源有限，難以滿足醫療需要。現有合成鵝去氧膽酸與熊去氧膽酸的路線多以牛羊膽酸為起始原料，但該原料價格昂貴。作者參照文獻[3-4]以廉價易得的豬去氧膽酸(hyodesoxycholic acid,HDCA)為原料合成鵝去氧膽酸與熊去氧膽酸，優化了合成工藝條件。其合成路線如圖1所示。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

豬去氧膽酸(純度≥98%)，自制，經熔點、1HNMR和MS確認；乙腈(色譜純)；重蒸餾水；其余試劑均為國產分析純。

YRT-3型熔點儀，天津大學精密儀器廠；Mercury Plus-400型核磁共振氫譜儀，美國Varian公司；Trace MS2000型氣相色譜質譜聯用儀，美國Finnigan公司；戴安P680型高效液相色譜儀；戴安UVD170U型檢測器；Grace Davison Discovery Sciences C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)。

1.2 方法

1.2.1 3α,6α-二對甲苯磺酰氧基-5β-膽烷酸甲酯(Ⅱ)的制備

取20 g豬去氧膽酸(Ⅰ)溶于120 mL甲醇中，加入12 mL濃鹽酸，攪拌回流3 h，經TLC檢測反應完畢；自然冷卻，加入Na2CO3中和至中性，減壓濃縮除去大部分甲醇，殘留物用乙酸乙酯提取，濾除無機鹽，濾液用飽和NaHCO3洗滌1次、水洗2次，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得白色固體即豬去氧膽酸甲酯20 g，粗產率為98%。

取16 g豬去氧膽酸甲酯溶于48 mL吡啶中，冰水浴攪拌溶解，然后分批加入20 g對甲苯磺酰氯(經石油醚重結晶)，冰水浴反應2 h，室溫攪拌24 h，經TLC檢測反應完畢;將反應液倒入加有碎冰的5%鹽酸溶液中，待固體析出后，抽濾，水洗，干燥，得白色固體粉末，再用乙酸乙酯重結晶，干燥，得白色固體即化合物Ⅱ26 g，產率為93%。

1.2.2 Δ5-3β-羥基膽烷酸甲酯(Ⅲ)的制備

將28.8 g醋酸鉀、160 mL DMF和24 mL水混合，升溫至110 ℃后，保溫15 min，加入24 g化合物Ⅱ，回流攪拌4 h，經TLC檢測反應完畢；冷卻至室溫，有白色固體析出，倒入1 200 mL加有碎冰的5%鹽酸溶液中，劇烈攪拌，過濾，水洗濾液至中性，干燥，得白色固體。向該白色固體中加入210 mL 2%的KOH甲醇溶液，室溫攪拌2 h，經TLC檢測反應完畢；用5%的鹽酸中和至中性，減壓濃縮除去大部分甲醇，加入冰水，待固體析出后，抽濾，水洗，重結晶(乙酸乙酯-石油醚)，干燥，得白色固體即化合物Ⅲ10.8 g，產率為83%。

a.37.5%HCl,MeOH b.p-TsCl,Py c.KAc,DMF,H2O d.異丙醇鋁，環己酮 e.四氯苯醌，EtOAc f.m-CPBA，CH2Cl2g.10%Pd/C,EtOH h.KBH4,MeOH i.NaOH,MeOH j.NBS,Acetone-H2O k.KBH4,CeCl3·7H2O,THF-MeOH圖1 鵝去氧膽酸與熊去氧膽酸的合成路線Fig.1 The synthetic routes of CDCA and UDCA

1.2.3 Δ4-3-酮膽烷酸甲酯(Ⅳ) 的制備

取10 g化合物Ⅲ溶于200 mL甲苯中，升溫至110 ℃，采用分水裝置蒸出約40 mL甲苯后，加50 mL環己酮，繼續蒸餾出約30 mL甲苯，加入3 g異丙醇鋁回流攪拌反應3 h，經TLC檢測反應完畢；冷卻至室溫，加入10%的硫酸溶液洗滌2次，分去水層，有機相用飽和NaCl溶液洗至中性，蒸干甲苯，用乙酸乙酯提取，水洗，用無水硫酸鈉干燥，濃縮，得到的固體再用無水乙醇重結晶，干燥，得到白色固體即化合物Ⅳ8.5 g，產率為85%。

1.2.4 Δ4，6-3-酮膽烷酸甲酯(Ⅴ) 的制備

取8 g化合物Ⅳ溶于250 mL乙酸乙酯中，加入8 g四氯苯醌和1 mL對甲苯磺酸，回流攪拌反應3 h，經TLC檢測反應完畢；自然冷卻，過濾，濾渣用乙酸乙酯洗滌，合并有機相，依次用5%NaOH溶液、飽和NaHSO3溶液、飽和NaCl溶液洗滌，用無水硫酸鈉干燥，濃縮，柱層析(V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶9)，得淡黃色固體即化合物Ⅴ6.5 g，產率為82%。

1.2.5 6α，7α-環氧-Δ4-3-酮膽烷酸甲酯(Ⅵ)的制備

取7.5 g間氯過氧苯甲酸加入到80 mL二氯甲烷中，冰水浴攪拌，滴加含6 g化合物Ⅴ的120 mL二氯甲烷溶液，保溫反應72 h，過濾，濾渣用二氯甲烷充分洗滌，合并有機相，用飽和NaHCO3溶液洗滌，然后水洗至中性，干燥，減壓濃縮，柱層析(V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶5)，得化合物Ⅵ4.7 g，產率為75%。

1.2.6 5β，7α-羥基-3-酮膽烷酸甲酯(Ⅶ)的制備

取4 g化合物Ⅵ溶于100 mL無水乙醇中，加入3 g 10%Pd/C，在少量吡啶催化作用下攪拌吸氫反應24 h，過濾，濾渣用二氯甲烷充分洗滌，合并有機相，水洗至中性，用無水硫酸鈉干燥，濃縮，柱層析(V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶4)，得化合物Ⅶ3.1 g，產率為78%。

1.2.7 鵝去氧膽酸(Ⅷ)的制備

取2 g化合物Ⅶ溶于50 mL甲醇中,加入1 g KBH4,室溫攪拌2 h,加入醋酸終止反應；蒸干溶劑，用乙酸乙酯提取,有機相用飽和NaHCO3溶液洗滌,然后水洗至中性,用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮，柱層析(V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶1)，得淡黃色固體1.7 g；分別加入20 mL乙醇、0.5 g氫氧化鈉和4 mL水，攪拌回流反應5 h,減壓回收溶劑至干，將得到的固體加水溶解，攪拌下用5%鹽酸溶液酸化，待固體析出后，抽濾，濾餅水洗至中性，干燥，用乙酸乙酯重結晶，得淡黃色固體即鵝去氧膽酸1.6 g，兩步產率82%，總產率為26%，純度經HPLC檢測為97.5%。

1.2.8 5β，3α-羥基-7-酮膽烷酸(Ⅸ)的制備

取1 g鵝去氧膽酸溶于48 mL丙酮-水(3∶1，體積比)中,再加0.65 g NBS，室溫下攪拌反應2 h，經TLC檢測反應完畢；加入20%NaHSO3，蒸干丙酮，然后用5%的鹽酸溶液酸化，待固體析出后過濾，濾渣水洗至中性，干燥，用無水乙醇重結晶后再干燥，得白色固體即化合物Ⅸ0.87 g，產率為87%。

1.2.9 熊去氧膽酸(Ⅹ)的制備

取0.8 g化合物Ⅸ和0.6 g CeCl3·7H2O溶于36 mL THF-MeOH(2∶1，體積比)中，室溫攪拌下加入0.4 g KBH4并反應3 h，蒸干溶劑，得淡黃色固體；用Na2CO3溶液溶解，過濾，濾液加5%鹽酸溶液酸化，待固體析出后過濾，水洗，干燥，用無水乙醇重結晶后再干燥，得白色固體即熊去氧膽酸0.68 g，產率85%，總產率為19%，純度經HPLC檢測為96.2%。

2 結果與討論

2.1 中間產物及目標產物的結構表征

化合物Ⅱ:m.p.168～170 ℃(文獻[5]值166～167 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3)，δ：7.71(d,2H,o-H×2)，7.36(d,2H,o-H×2)，7.34(d,2H,m-H×2)，7.32(d,2H,m-H×2)，4.78(t,1H,6β-H)，4.31(m,1H,3β-H)，3.68(s,3H,24-OCH3)，2.50(s,3H,p-CH3)，2.46(s,3H，p-CH3)，0.88(d,3H,21-CH3)，0.80(s,3H,19-CH3)，0.59(s,3H，18-CH3)。

化合物Ⅲ:m.p.142～144 ℃(文獻[5]值143～144 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3),δ:5.35(d,1H,6-H),3.68(3H,s,24-OCH3),3.52(m,1H,3H),0.98(s,3H,19-CH3),0.91(d,3H,21-CH3),0.67(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅳ:m.p.122～124 ℃(文獻[3]值122～124 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3),δ:5.72(s,1H,4-H),3.67(s,3H,24-OCH3),1.13(s,3H,19-CH3),0.93(d,3H,21-CH3),0.70(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅴ:m.p.153～154 ℃(文獻[3]值151～153 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3),δ:6.13(d,1H,6-H),6.10(d,1H,7-H),5.67(s,1H,4-H),3.68(s,3H,24-OCH3),1.10(s,3H,19-CH3),0.93(d,3H,21-CH3),0.76(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅵ:m.p.148～150 ℃(文獻[3]值149～151 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3),δ:6.10(s,1H,6-H),3.68(s,3H,24-OCH3),3.45(d,1H,7-H),3.34(d,1H,6-H),1.20(s,3H,19-CH3),0.93(d,3H,21-CH3),0.74(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅶ:m.p.127～128 ℃(文獻[3]值128～129 ℃)。1HNMR( 400 MHz，CDCl3)，δ:3.84(s,1H,7-H)，3.68(s,3H,24-OCH3)，1.20(s,3H,19-CH3)，0.93(d,3H,21-CH3)，0.66(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅷ:m.p.142～143 ℃(文獻[6]值144～146 ℃)。MS(m/z):392.6。1HNMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ:11.91(s,1H,24-COOH)，4.31(d,1H,3α-OH)，4.11(d,1H,7α-OH)，3.62(m,1H,7-CH)，3.18(m,1H,3-CH)，0.97(d,3H,21-CH3)，0.87(s,3H,19-CH3)，0.62(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅸ:m.p.204～206 ℃(文獻[7]值206～210 ℃)。1HNMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ:11.96(s,1H,24-COOH)，4.48(d,1H,3α-OH)，2.90(q,1H,8-CH)，2.44(t,1H,6-CH)，1.10(d,3H,21-CH3)，0.92(s,3H,19-CH3)，0.65(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅹ:m.p.201～202 ℃(文獻[8]值197～202 ℃)。MS(m/z):392.6。1HNMR( 400 MHz，DMSO-d6),δ:11.94(s,1H,24-COOH),4.44(d,1H,3α-OH),3.87(d,1H,7β-OH),0.99(d,3H,21-CH3),0.88(s,3H,19-CH3),0.61(s,3H,18-CH3)。

2.2 合成工藝的優化

1)制備化合物Δ5-3β-羥基膽烷酸甲酯(Ⅲ)時，參照文獻[5]的條件，反應發現產生一極性比產品較小的雜質，經熔點和核磁共振確認該雜質為Δ5-3β-乙酰基-膽烷酸甲酯，為使其轉化為化合物Ⅲ，設計了不同KOH含量的甲醇溶液與不同水解時間的正交實驗，發現2%KOH 的甲醇溶液室溫水解2 h時的效果最好，Δ5-3β-羥基膽烷酸甲酯(Ⅲ)的產率明顯提高。

2)制備化合物Δ4-3-酮膽烷酸甲酯(Ⅳ)時，文獻[3]采用柱層析，本研究嘗試用無水乙醇重結晶純化，得到了化合物Ⅳ純品。

3)制備化合物Δ4，6-3-酮膽烷酸甲酯(Ⅴ)時，先參照文獻[3]使用醋酸作催化劑，發現產物中雜質較多，然后參照文獻[9]，嘗試以無水AlCl3、草酸、對甲苯磺酸作為催化劑，發現對甲苯磺酸作催化劑時產物雜質少，且產率有所提高。

4)制備熊去氧膽酸(Ⅹ)過程中，對鵝去氧膽酸進行選擇性還原7位酮基時文獻[8]采用了劇烈的、不易控制的堿金屬鈉作為還原劑，不宜進行工業化生產。本研究改用溫和的還原劑硼氫化鉀在CeCl3催化作用下對7位酮基進行立體選擇性β-還原得到熊去氧膽酸。改進后的工藝條件溫和、操作簡單，適宜工業化生產。

3 結論

以資源豐富的豬去氧膽酸為原料，經甲酯化后與對甲苯磺酰氯反應生成3α，6α-二對甲苯磺酰氧基-5β-膽烷酸甲酯，經消去、Oppenauer氧化、 6、 7位脫氫、環氧化、催化氫化、3位選擇性還原合成鵝去氧膽酸，總產率為26%，純度經HPLC檢測為97.5%；再由鵝去氧膽酸經選擇性氧化7位羥基、選擇性還原7位酮基合成熊去氧膽酸，產率為74%,熊去氧膽酸總產率為19%，純度經HPLC檢測為96.2%。通過熔點、MS和1HNMR測定確證了各關鍵中間體及目標產物的結構。合成工藝改進后，原料豬去氧膽酸來源豐富易得，反應條件溫和(不需要高溫高壓或低溫操作)，易于實現工業化生產，具有較高的應用價值。

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