乳酸菌能量代謝的蛋白質組學研究進展

劉海新

（青島科技大學化工學院，山東 青島266042）

乳酸菌是非常有趣的生物體，約3億年前，它們起源于厭氧到需氧的過渡時期，并且在演化過程中從未獲得過合成血紅素的能力。存在于細胞色素、過氧化物酶和過氧化氫酶中的卟啉可使它們進行有氧和無氧呼吸及氧自由基的解毒作用。乳酸菌的病原菌種，即鏈球菌，可以通過來自動物宿主的溶血素混入細胞色素來減少血紅素，從而獲得減少氧氣及加快新陳代謝的功能性呼吸鏈，其它乳酸菌物種則被迫生活在具有較低能量的發酵代謝中。與厭氧細菌不同的是，乳酸菌在氧氣中也可以存活[1］。由于缺乏血紅素，它們抵抗氧氣的防御機制主要是以金屬的積累為基礎。事實上，有些乳酸菌物種能夠在細胞內積累大量的錳（可達25mmol）、硒和鋅。錳可以充當類似超氧化物歧化酶的角色，而硒可以在硒代胱氨酸系統中充當自由基清除劑，鋅構成了氧自由基的離子捕集器。所有這些能力使乳酸菌成為耐氧的厭氧菌，也為其憑借腸道環境中的金屬濃度成為有益菌種提供了可能。某些異型發酵的乳酸菌物種可以通過一個簡短的電子傳輸鏈（NADH－黃素－O2）將氧氣還原為水，從而消除氧氣，并最終通過乙酰磷酸產生的醋酸將NADH重新氧化為NAD＋，從而維持了系統的循環。

由于乳酸菌的生物合成能力有限，因此它們可以與為其提供糖類、維生素和氨基酸的動植物形成共生或寄生關系。另外，乳酸菌可以生活在食物生態環境中，因而普遍存在于水果、蔬菜、奶酪、葡萄酒，特別是牛奶中。牛奶因為含有豐富的乳糖，從而成為乳酸菌首選的生活環境。異型發酵乳酸菌可以產生100%的乳酸，兼同型和異型發酵的乳酸菌可以產生乳酸、乙醇和乙酸。在兼同型和異型發酵的乳酸菌中，1mol戊糖發酵代謝可以多產生2mol ATP。同型發酵的乳酸菌可以從己糖中獲得2mol ATP，而異型乳酸菌只能得到1mol ATP[2］。除了底物磷酸化，一些乳酸菌還可以從質子運輸中獲得能量。

乳酸菌具有悠久的歷史、顯明的特征及與人類生活息息相關等特點。正是憑借這些特點，乳酸菌受到了各國科研人員的關注，近年來相關研究成果層出不窮。特別是最近幾年，利用蛋白質組學作為研究工具對乳酸菌進行研究更是成為了生物、醫學界關注的熱點。作者在此概述了乳酸菌能量代謝的蛋白質組學研究進展，并討論了代謝路徑之間的相互關系。

1 乳酸菌替代能源途徑的影響因素

由于乳酸發酵是乳酸菌獲得能量的主要途徑，因此在同型乳酸菌物種和可以產生醋酸的異型乳酸菌物種中，減小pH值十分必要。在某些物種中，pH值減小可以通過質子或底物的同向運輸來實現，系統產生電子并排出質子，但不能在低pH值下工作，因為乳酸的pKa是3.9，低于此值時乳酸不能解離，只可以通過被動擴散排出，每摩爾乳酸只能排出1個質子[3］。低pH值可能誘發其它系統來緩沖乳酸的酸性，如氨基酸脫羧或ADI途徑等。

1.1 氨基酸脫羧反應對pH值的控制

在大腸桿菌中，細胞外的低pH值將引起cad編碼操縱子由賴氨酸轉換為尸胺，并引起谷氨酸轉化為氨基丁酸谷氨酸脫羧酶[4］，在這些比乳酸菌演化更高級的革蘭氏陰性菌中，氨基酸脫羧路線的活化與能源需求沒有必然的聯系，因為還有其它可供選擇的發酵途徑。因此，氨基酸脫羧反應的主要生理功能是控制pH值，例如為了在胃管道中存活而調節pH值。乳酸菌中氨基酸的脫羧反應至少在3個水平上進行pH值調節：微生物種群的篩選、脫羧酶的催化活化和脫羧酶合成的過度表達。

1.2 ADI途徑

和氨基酸脫羧反應類似，人們發現葡萄酒中的乳酸菌的ADI途徑也可被不同的酸性pH值（pH＞3.2）激活。由此路徑產生的氨氣，有助于細胞承受低pH值（pH＜4）及保護口腔鏈球菌[5－6］、乳酸菌和酸性應力下的干酪乳酸球菌。相比之下，在酵母株乳酸菌Sanfrancisciensis中觀測到不需要控制pH值的ADI途徑表達。

1.3 乳酸發酵

乳酸發酵通常在pH值呈酸性（pH值為3左右）時進行。Gockowiak和Henschke指出，L－蘋果酸的降解速率在pH值為3.5和2.9時分別以每周3.1g·L－1和8.0g·L－1的速率急劇下降。Rosi等[7］也發現乳酸菌的代謝活性在pH值為3.2時會下降，因為pH值為3.2時蘋果酸的完全降解需要15d，而pH值為3.6時只需10d。

1.4 ATP的控制

促進ATP合成的條件不利于 ADI的途徑[8］。ATP濃度和乳酸乳球菌的氨基甲酸酯類激酶的生物合成之間的反比關系表明，ADI途徑是在ATP衰竭的情況下被激活的[9－10］。有假設認為即使ATP不足，三磷酸腺苷和精氨酸也可以通過促進擴散或利用低pH值條件下的跨膜質子梯度進入細胞。

1.5 生長期的控制

將不同生長期當作同一參數來評估路徑的激活是不正確的。事實上，在每個階段各種復雜因素在不同程度上發揮作用，這取決于培養基條件、媒介、菌株、養分供應和輔源營養等等。Pessione等通過胺測定和蛋白質組學研究，檢測到組胺的過度積累與乳酸桿菌穩定生長期的HDC的過度表達相關聯。對乳酸乳球菌NCDO2118中γ－氨基丁胺的研究也得到了類似的結果。

2 碳底物對乳酸菌能量代謝的影響

除了pH值降低和ATP減少之外，人們認為激活普通有機酸和氨基酸產能反應的另一個因素是碳水化合物不足。而對于MLF、氨基酸脫羧和ADI途徑中糖類的影響，文獻中卻顯示出相反的結果。從物種到物種（有時從菌株到菌株）之間存在著巨大的差異[11］。

2.1 氨基酸脫羧反應

糖類可以影響氨基酸脫羧路徑。Lonvaud－Funel等[12］研究表明，發酵糖的不足可以提高澳球菌中組胺生產量。隨后Rollan證實澳球菌中葡萄糖的量不影響HDC的催化過程，由此引入了對HDC操縱子進行生物合成的假說。最近，Pessioneet等對Lactobacillus菌種的研究表明，葡萄糖耗盡時存在HDC的誘導。此外，雖然糖消耗能增強組氨酸脫羧作用且不發生酪胺積累，但對L.hilgardii和P.parvulus的研究已明確證實了葡萄糖和果糖對HDC編碼操縱子的抑制作用。糖在氨基酸脫羧途徑中的影響尚未完全明確，初步推斷，它與特定的氨基酸、氨反應及與不同菌種的關系似乎比其它微生物物種更加密切，因為L.hilgardii同時具有兩種現象。

2.2 ADI途徑

1987年，Poolman等[9］在乳酸乳球菌的ADI酶生物合成途徑中進行了葡萄糖的陰性對照研究，結果表明，cAMP的拮抗與分解抑制是相兼容的。在果糖加蔗糖和葡萄糖加乳糖中，鏈球菌和乳酸菌Leichmanii得到了相似的結果。微生物的合成抑制和負催化調控已經通過乳酸球菌與L.buchneri中3個主要的ADI途徑酶（ADI、OTC、CK）得到證實。盡管在L.sakei中已發現，但負合成調控在這些研究結果中可能是由于物種或菌種差異引起的，ADI途徑的最終結果可能是合成和催化調節的共同結果。Jonsson和de Angelis等對L.plantarum、L.buchneri和Sanfrancisciensis的研究證明了葡萄糖在ADI途徑中發揮作用。這些研究表明要激活ADI途徑，少量的葡萄糖是必需的。pH值較高時，精氨酸才可以進入細胞，并在精氨酸操縱子作用下發揮其激活作用。然而，仍不能解釋為什么都能產生能量及不同的糖（果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖）或高血糖濃度卻產生相反效果等問題。

2.3 蘋果酸－乳酸發酵

乳酸菌中糖的代謝和蘋果酸－乳酸發酵之間的關系并沒有得到廣泛研究。Davies等觀察到，澳球菌生長中，在存在葡萄糖、果糖和蘋果酸的情況下，蘋果酸是同時與乳酸產生及消耗的，然而葡萄糖和果糖均不減少。這表明，碳底物酸和糖同時存在時，細菌傾向于通過蘋果酸－乳酸發酵消耗蘋果酸。其它研究也表明，在沒有發酵糖的蘋果酸合成培養基中乳酸菌不能生長。因此，作為MLF唯一補充碳源，盡管L－蘋果酸可以為利用底物補充能量，但它不能作為增長過程的唯一碳源。Landete等還觀察到蘋果酸乳酸酶的表達可以被葡萄糖激活，而蘋果酸酶基因的表達卻被葡萄糖抑制[13］。

3 結語

乳酸菌中產生能量的蛋白質網絡比以前人們認為的要復雜得多。利用尖端的技術，如轉錄、蛋白質組學研究發現，生物合成調控是普遍存在的，而催化控制至關重要，調節基因表達往往存在不同的路線。此外，蛋白水解系統和蛋白激酶是相互協作的，它們一起抵制能量產生過程中pH值的變化等，這是乳酸菌通過漫長的進化所得到的結果。

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