蓖麻愈傷組織對銅的抗性研究

康 薇，董化洋，金裕華，閔建華，鄭 進,2

(1.湖北理工學院，湖北 黃石 435003；2.礦區環境污染控制與修復湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435003)

植物修復是利用綠色植物對重金屬的超富集作用來降低土壤的重金屬含量，實現對重金屬污染土壤的治理。由于具有物理、化學修復所無法比擬的費用低、不破壞場地結構、不造成地下水二次污染以及能夠進行大規模治污等優勢，植物修復被認為是國際上最有前途的土壤重金屬污染治理技術[1]。近年來，隨著Ni、Zn、Mn、Pb、Cd、Cu等多種重金屬超富集植物的相繼被發現和各種先進理化分析測試手段的應用，該領域已經成為重金屬污染土壤修復研究的熱點，在超富集植物對重金屬的吸收、轉運和體內解毒機制等方面取得了很大的進展[2-7]。但是，這些成果主要來自對成體植物的研究，較少涉及離體培養的植物組織或細胞。離體培養的植物材料相對于成體植物而言，具有重復性好、培養條件易于控制和不受自然環境影響等特點，其在研究植物重金屬超富集機理方面的潛在優勢已經引起人們的關注[8]。

蓖麻(RicinuscommunisL.)是一種新發現的銅超富集植物，在修復銅污染土壤方面具有較大的潛力[9-10]。作者在前期研究中，采用組織培養技術誘導出蓖麻愈傷組織，并對愈傷組織的耐銅性進行了初步測試[11]。在此基礎上，通過研究銅脅迫下蓖麻愈傷組織的增長及其銅吸收，探討蓖麻愈傷組織對銅的抗性，為進一步篩選銅抗性蓖麻細胞及其超富集機理研究奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料

蓖麻愈傷組織由本課題組采用蓖麻種胚誘導獲得[11]。

1.2 培養基及培養條件

培養基[11]：MS培養基，6-BA 0.8 mg·L-1，NAA 0.2 mg·L-1，瓊脂 6 g·L-1，蔗糖30 mg·L-1。

愈傷組織繼代培養條件：溫度(26±2) ℃，光照14 h·d-1，光照強度3 000 lux。

1.3 愈傷組織培養及銅抗性測定

將CuSO4·5H2O配制成水溶液，按質量濃度10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1、50 mg·L-1、60 mg·L-1、70 mg·L-1、80 mg·L-1分別加入到愈傷組織繼代培養基中，每個濃度5瓶，每瓶裝有培養基100 mL，接種愈傷組織2 g。以培養基不加CuSO4·5H2O為對照，3次重復。接種培養后，每隔7 d取出3瓶測愈傷組織鮮質量后，將愈傷組織置于60 ℃干燥箱內烘干至恒質量，稱量，取平均值，并按下式計算愈傷組織對銅的抗性指數：

式中：m1為處理愈傷組織干質量；m2為對照愈傷組織干質量。

1.4 愈傷組織銅含量測定

將新鮮的愈傷組織取出后，先用濃度為10 mmol·L-1的Sr(NO3)2溶液沖洗2～3次，洗去愈傷組織表面吸附的銅離子，再用去離子水沖洗3～4次。用火焰原子吸收光譜儀(Varian AA240FS)測定愈傷組織銅含量。

2 結果與討論

2.1 愈傷組織增長量與銅濃度的關系(圖1)

圖1 培養4周后不同銅濃度條件下愈傷組織增長量Fig.1 The growth of the callus after culturing 4 weeks under different copper concentrations

由圖1可以看出，愈傷組織的增長量與培養基銅濃度關系密切，隨著銅濃度的增大，愈傷組織增長量呈下降趨勢，并且愈傷組織鮮質量和干質量的下降趨勢基本一致。培養4 周后，對照和銅濃度(mg·L-1)為10、20、30、40、50、60、70、80各處理愈傷組織的干質量平均增長量(mg·L-1)依次為0.62、0.58、0.54、0.45、0.38、0.30、0.21、0.23、0.21，可見，培養基銅濃度超過60 mg·L-1后，愈傷組織的生長明顯受到抑制，其增長基本處于停止狀態。用銅濃度(mg·L-1)為20、40、60的培養基分別連續繼代培養愈傷組織6周后，銅濃度為40 mg·L-1條件下，愈傷組織呈淡黃色，增殖較快，基本能夠適應培養基的高銅環境(圖2)。

圖2 連續繼代培養6周的愈傷組織Fig.2 The callus after culturing 6 weeks under different copper concentrations

銅是植物必需的營養元素，但過量的銅會對植物造成傷害。一般認為，水培介質中植物銅中毒的臨界值是0.06 mg·L-1[12]。植物組織培養中常用的MS培養基，其銅濃度為0.025 mg·L-1。相對于成體植物而言，愈傷組織對銅更為敏感，本實驗中蓖麻愈傷組織能夠在銅濃度為40 mg·L-1的培養基上完成多次繼代，表現出較強的銅抗性。

2.2 愈傷組織對銅的抗性

楊居榮等認為，抗性是指生物對不良條件的抵抗能力，抗性的產生可由先天遺傳，也可以由后天獲得[13]。離體培養的蓖麻愈傷組織在銅污染條件下，能夠正常繼代增殖，表明其具有較強的抗變能力。通過計算抗性指數(圖3)可知，不同培養時間愈傷組織對銅的抗性指數差異較大。在培養的第1 周，抗性指數較大，但各處理間抗性指數差異不明顯，這可能與愈傷組織處在接種后的啟動培養階段，對培養基養分吸收不大有關。從第2周開始，隨著銅濃度的增大，各處理抗性指數逐漸降低。到第4周，銅濃度為60 mg·L-1、70 mg·L-1、80 mg·L-1處理的抗性指數僅為33.87%、37.10%和33.87%，愈傷組織的生長受到抑制；銅濃度為10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1處理具有較高的抗性指數，依次為93.55%、87.10%、72.58%、61.29%，并且都高于第3周的抗性指數。可能的原因是，延長馴化處理時間，可以產生更好的抗性效果[13]。參考愈傷組織在銅濃度為40 mg·L-1條件下繼代培養6周的生長情況，培養基銅濃度40 mg·L-1可以作為篩選銅抗性蓖麻愈傷組織的臨界值。

圖3 愈傷組織對銅的抗性指數Fig.3 Copper-resistant indexes of the callus

2.3 愈傷組織對銅的吸收

圖4 不同培養時期愈傷組織的銅含量Fig.4 Copper content of the callus in different culturing periods

通過測定不同培養時期愈傷組織的銅含量(圖4)可知，隨著培養時間的延長，愈傷組織的銅含量呈上升趨勢，但不同時間段銅含量的升幅明顯不同；在第2周之前，上升速度較快，第2周開始減緩，到第3周和第4周基本維持在一個相對穩定的水平。第4周銅濃度(mg·L-1)為10、20、30、40、50、60、70、80各處理愈傷組織的銅含量(mg· g-1)依次為0.33、0.54、1.16、1.40、1.55、1.64、1.65、1.62，表現出較強的銅吸收作用。

茅野充男[13]認為，植物重金屬抗性機制具有多方面的表現，一種方式是減少對重金屬的吸收量；另一種方式是重金屬進入植物體內后與體內某些物質結合，形成無毒或者毒性低的產物，減輕對植物的傷害；還有其它的生化、生理應急機制等。本實驗中，隨著培養時間的延長，蓖麻愈傷組織銅含量呈現出類似于飽和吸收的相對穩定現象，是否為植物對重金屬脅迫環境的一種適應機制，有待在今后的研究中加以探討。

3 結論

通過向培養基中添加不同濃度的銅，研究了銅脅迫下蓖麻愈傷組織對銅的抗性與吸收作用。結果表明，愈傷組織的增長量與培養基中銅濃度關系密切，隨著銅濃度的增大，愈傷組織增長量呈下降趨勢。銅濃度為60 mg·L-1時，愈傷組織的增長基本處于停止狀態；銅濃度為40 mg·L-1時，愈傷組織呈淡黃色，增長較快，表現出較強的銅抗性，并且這種抗性可以保持至連續繼代培養6周之后。愈傷組織對銅的抗性與培養時間和培養基銅濃度密切相關，不同培養時間愈傷組織對銅的抗性指數差異較大，培養至第4周時，銅濃度為60 mg·L-1、70 mg·L-1、80 mg·L-1處理的抗性指數僅為33.87%、37.10%和33.87%，銅濃度為10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1處理的抗性指數依次達到93.55%、87.10%、72.58%和61.29%，并且都高于第3周的抗性指數。因此，培養基銅濃度40 mg·L-1可以作為篩選銅抗性蓖麻愈傷組織的臨界值。實驗同時證實，蓖麻愈傷組織具有較強的銅吸收作用，第4周銅濃度(mg·L-1)為10、20、30、40、50、60、70、80各處理愈傷組織的銅含量(mg· g-1)依次為0.33、0.54、1.16、1.40、1.55、1.64、1.65、1.62。

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