羊水ABH血型物質測定與ABO血型基因分型＊

陳 江，逯心敏，郭 渝，胡 偉

（四川省宜賓市第二人民醫院檢驗科，四川宜賓 644000）

羊水ABH血型物質測定與ABO血型基因分型＊

陳 江，逯心敏，郭 渝，胡 偉

（四川省宜賓市第二人民醫院檢驗科，四川宜賓 644000）

目的通過檢測羊水ABH血型物質和序列特異性引物-聚合酶鏈反應（PCR-SSP）基因技術檢測胎兒羊水細胞ABO血型基因型，鑒定胎兒ABO血型。方法選取妊娠16～25周的孕婦53例，抽取羊水，利用間接凝集實驗測定羊水ABH血型物質；將羊水細胞進行分離，提取羊水細胞DNA，運用PCR-SSP技術分析其ABO血型基因型。結果16例羊水標本為非分泌型，占30.2%，37例羊水標本為分泌型，占69.8%；48例羊水標本通過PCR-SSP方法檢測出了ABO血型的基因型。經基因鑒定的胎兒羊水細胞ABO血型與羊水分泌型ABH血型物質檢測結果一致。結論PCR-SSP技術可以準確地檢測胎兒羊水細胞的ABO血型。

ABO血型系統；羊水；細胞；序列特異性引物-聚合酶鏈反應；ABH血型物質

母嬰血型不合，可引起胎兒或新生兒時期的免疫性溶血病。母體產生的免疫抗體，通過胎盤進入胎兒體內，可使胎兒紅細胞凝集，發生溶血，引起死胎、死產、出生缺陷及新生兒溶血病［1－2］。為了有效預防新生兒溶血病的發生，產前確定胎兒血型十分必要，為此本文抽取了53例孕婦羊水，通過測定胎兒羊水ABH血型物質和序列特異性引物－聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction with sequence specific primes，PCR-SSP）基因分型檢測胎兒羊水細胞ABO血型，來判斷胎兒血型。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年3～10月在本院孕16～25周、年齡21～38歲的孕婦53例，采集羊水（雙方簽署知情同意書），每人2份，取樣注意避免母血污染。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與材料 抗血清：抗A效價1∶64，抗B效價

1∶128，抗 H效價1∶32，購自長春博德；PCR-SSP ABO血型試劑，購自天津秀鵬生物技術開發有限公司；DNA提取試劑，購自杭州博日科技有限公司。

1.2.2 標準抗血清制備 （1）標記試管：3排18支，分別抗A、抗B及抗 H。每排再標2、4、8、16……。（2）稀釋：每管加生理鹽水50μL。每排第1管對應加抗A、抗B及抗H血清50μL，倍量稀釋成2、4、8、16……稀釋液。（3）加2%懸紅：每排各管對應加懸紅50μL，振搖混勻，1 400r／min，離心15s。（4）結果：以3＋為標化血清的最適稀釋度。

1.2.3 羊水ABH血型物質測定 （1）無菌抽取羊水5～10mL，經1 400r／min離心5min后留取上清液備用。（2）排列試管3支，分別標明A、B、H，3管各加羊水1滴，每管加相應標準抗血清1滴。混勻，置室溫，中和10min。（3）每管加相應2%標準紅細胞懸液1滴，混勻，1 400r／min離心15s，觀察結果。

1.2.4 羊水細胞培養 取羊水專用培養基［3］，加入新鮮小牛血清（56℃，30min滅活補體），使終濃度達到10%。將5～10mL羊水接種于上述培養基中，置5%CO2孵箱中，37℃飽和濕度下培養，每隔48h換培養基。培養3～5d后，在倒置顯微鏡下觀察，如細胞貼壁生長良好。大部分或全部爬壁生長良好后，即可終止傳代生長。

1.2.5 引物設計 引物驗證經Primer 5.0軟件設計，通過NCBI-BLAST數據庫，輸入相應引物進行驗證確認。O1基因型：上游引物5′-TTA AGG GGA AGG ATG TCC TCG TCGTA-3′，Non O1基因型：下游引物5′-TAA GTG GAG GAGTG AGT TGT G-3′，共 同 引 物 5′-ATA TAT ATG GCA AAC ACA GIA ACC AAT G-3′；O2基因型：上游引物5′-GAC CCC CGG AAG AAG CTA TTG GA-3′，Non-O2基因型：下游引物5′-CGA CCC CCG CAA GAA GGC C-3′，共同引物5′-AGT GGA CGT GGA CAT GGA GTT CC-3′；B基因型：上游引物5′-ATC GAC CCC AGG GGA AGA CAG G-3′，Non-B 基 因型：下游引物5′-CCG ACC CCC CGA AGA GCC-3′；A2基因型：上游引物5′-GAG GCG GTC CGG AAG CG-3′，Non-A2基因型：下游引物5′-GAG GCG GTC CGG AAC ACG-3′，共同引物5′-GGG TGT GAT TTG AGG TGG GGA C-3′。

1.2.6 羊水細胞的DNA提取 將收集的羊水細胞于2 500 r／min離心10min，棄去上清液；再加入生理鹽水5～10mL，2 500r／min離心10min，棄去上清液。采用博日DNA提取試劑盒快速提取羊水細胞DNA，通過2%瓊脂電泳鑒定提取的質量。

1.2.7 PCR擴增 PCR反應體系為20.0μL含模板2.0μL（約50ng），引物1.5μL，dNTP 1.6μL（0.4mmol），10×Buffer緩沖液2.0μL，Taq酶1.0U，加雙蒸水至20.0μL；PCR反應條件為94℃預變性4.0min，94℃變性1.5min，52℃退火2.0min，72℃延伸2.0min，共30個循環。

1.2.8 PCR擴增產物的檢測 取PCR擴增產物2.0μL，2.5%瓊脂糖凝膠電泳（T＝6.0%，C＝3.3%，凝膠規格為82mm×64mm×0.75mm）。電極緩沖液為1×TBE。將加有1／5體積上樣緩沖液的酶切產物電泳，電壓220V，電泳20～30min。紫外線下成像。結果判斷見相應說明書。

2 結 果

2.1 羊水ABH血型物質檢測結果及分布 53例羊水ABH血型物質結果中非分泌型16例（30.2%），A型分泌型13例（24.5%），B 型 分 泌 型 6 例 （11.3%），0 型 分 泌 型 15 例（28.3%），AB型分泌型3例（5.7%）。

2.2 PCR-SSP法檢測結果 53例羊水細胞DNA除5例未能正確檢出，其余均測出ABO血型。表現型為A型有18例，基因型 O1A1：7例，A1A1：2例，A1O2：9例；B型有8例，其基因型為O1B：4例，O2B：4例；表現型為O型有19例，其基因型為O1O1：3例，O1O2：11例，O2O2：5例，表現型為 AB型有3例，基因型均為A1B。

2.3 結果比對 除非分泌型的結果和無效檢測結果外，孕婦羊水血型物質分泌型檢測結果與基因分型結果均一致，說明兩種方法能達到臨床檢測的要求。

3 討 論

血型是以血液抗原形式表現出來的一種遺傳性狀，已經發現并成為國際輸血協會承認的血型系統有30多種［4］，ABO血型是最早發現的一個血型系統，也是應用最廣、與臨床輸血最密切、最重要、研究和認識較深入的一個血型系統。ABH血型抗原在5～6周胎兒RBC已可測出［5］，出生時抗原性只達成人的25%～50%，在出生后18個月時才能充分表現出抗原性［6］。

所有ABO血型的抗原都由H物質合成而來，Se／se基因和H／h基因都可以控制合成H物質。Se／se基因的表達決定體液中是否出現ABH抗原，決定ABH抗原為分泌型或非分泌型，人類的這種分泌狀態受控于分泌座位（FUTZ）的一對等位基因，即Se和se，Se基因編碼有活性的為α2-L巖藻糖基轉移酶；se是無效基因。大部分群體的20%為非分泌型，是se基因的純合子。H／h基因的表達決定RBC上是否出現ABH抗原。再依ABO基因表達的不同，合成出不同抗原形成不同的 ABO 血型［7］。

母嬰ABO血型不相容是臨床新生兒溶血癥的常見原因，新生兒溶血病起源于胎兒從父親方面繼承了一些母親沒有的RBC抗原，使得母嬰血型不合，母體存在與胎兒RBC血型抗原相應的免疫性抗體，此免疫性抗體可以通過胎盤進入胎兒體內，并包被在胎兒RBC上，在分娩前、后加速胎兒RBC破壞發生溶血，造成胎兒發生以溶血為主要損害的一種被動免疫性疾病［8］，常常導致胎兒宮內感染，早產、胎兒智力低下，嚴重的造成胎兒死亡。國內常見的血型不合引起的新生兒溶血為ABO及Rh血型不合，其中以ABO不合者居多，Rh不合者次之［9］。因此，及早分析胎兒的血型，對于預防和治療具有重要的臨床意義，胎兒的血型鑒定以前主要是通過胎兒父母的血型，按照孟德爾遺傳規律推算出的子代血型，具有一定的盲從性和主觀性，通過宮內穿刺采集胎兒血液進行胎兒血清學的ABO鑒定，有較大的風險性，容易造成胎兒損傷，甚至導致胎兒死亡，且胎兒ABO血型抗原發育不成熟，RBC的凝聚力只有成人的20%，常常導致血型鑒定困難容易造成錯判或誤判［10］。

人類ABO基因定位于第9對染色體長臂末端，ABO血型系統的3個基因，由7個外顯子組成［11］。ABO血型系統不同的表型是由其基因水平上的幾個核苷酸的不同所決定［12］。PCR-SSP技術檢測ABO血型基因型是利用ABO基因發生突變位點的不同核甘酸，分別設計一系列序列特異性引物，直接擴增ABO血型基因型物質片段從而測得ABO血型及其亞型［13－14］。

本次實驗共收集到53例羊水標本，均來自為16～25周的健康孕婦，通過間接凝集抑制試驗測得的ABO分泌型37例（69.8%），非分泌型16例（30.2%），稍高于文獻報道［15］，可能為胎兒尚未成熟，羊水中分泌較少。同時對53例羊水標本進行了細胞培養，通過PCR-SSP技術進行了基因分型，除5例標本可能因提取DNA相對不夠加之天氣炎熱，DNA可能降解，未能成功檢測外，其余均能正常檢測，PCR-SSP技術鑒定胎兒羊水細胞血型實驗顯示，結果清晰可靠，方法可行，與分泌型的檢測比對結果均為一致。

本研究表明，采用PCR-SSP法檢測胎兒羊水細胞ABO血型基因型來確定胎兒血型是準確可靠的。可有效克服常規血清學檢測技術的不足和新生兒血型免疫系統不完善，以及血型結果影響因素較多的問題。能較早快速準確地鑒定胎兒血型，可直接用于臨床檢測，有助于臨床新生兒溶血癥的預防和治療。

［1］Towns D，Hannon J，Hendry J，et al.Hemolytic disease of the fetus and newborn caused by an antibody to a lowprevalence antigen，anti-SARA［J］.Transfusion，2011，51（9）：1977-1979.

［2］Sammar M，Nisemblat S，Fleischfarb Z，et al.Placenta-bound and body fluid PP13and its mRNA in normal pregnancy compared to preeclampsia，HELLP and preterm delivery［J］.Placenta，2011，32Suppl：S30-36.

［3］Roubelakis MG，Bitsika V，Zagoura D，et al.In vitro and in vivo properties of distinct populations of amniotic fluid mesenchymal progenitor cells［J］.J Cell Mol Med，2011，15（9）：1896-1913.

［4］Franchini M，Favaloro EJ，Targher G，et al.ABO blood group，hypercoagulability，and cardiovascular and cancer risk［J］.Crit Rev Clin Lab Sci，2012，49（4）：137-149.

［5］Moussa H，Tsochandaridis M，Jemni-Yacoub S，et al.Fetal RhD genotyping by real time quantitative PCR in maternal plasma of RhD-negative pregnant women from the Sahel of Tunisia［J］.Ann Biol Clin（Paris），2012，70（6）：683-688.

［6］Gloria-Bottini F，Cozzoli E，Neri A，et al.Effect of smoking and ABO blood groups on maternal age at child bearing and on birth weight［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2011，159（1）：83-86.

［7］Emeribe AO，Igweagu CA，Osim EE.ABH secretor status in saliva of Calabar Municipality residents［J］.East Afr Med J，1992，69（1）：27-30.

［8］Stasi R.Rozrolimupab，symphobodies against rhesus D，for the potential prevention of hemolytic disease of the newborn and the treatment of idiopathic thrombocytopenic purpura［J］.Curr Opin Mol Ther，2010，12（6）：734-740.

［9］Zuppa AA，Cardiello V，Lai M，et al.ABO hemolytic disease of the fetus and newborn：an iatrogenic complication of heterologous assisted reproductive technology-induced pregnancy［J］.Transfusion，2010，50（10）：2102-2104.

［10］Klarmann D，Eggert C，Geisen C，et al.Association of ABO（H）and I blood group system development with von Willebrand factor and FactorⅧplasma levels in children and adolescents［J］.Transfusion，2010，50（7）：1571-1580.

［11］Klimant E，Glurich I，Mukesh B，et al.Blood type，hormone receptor status，HER2／neu status，and survival in breast cancer：a retrospective study exploring relationships in a phenotypically well-defined cohort［J］.Clin Med Res，2011，9（3／4）：111-118.

［12］Jukic I，Bingulac-Popovic J，Dogic V，et al.Evaluation of ABO blood groups as a risk factor for myocardial infarction［J］.Blood Transfus，2012，11（3）：464-465.

［13］Prager M.Molecular genetic blood group typing by the use of PCR-SSP technique［J］.Transfusion，2007，47（1Suppl）：S54-59.

［14］陳志忠，廖揚勛，陳尚良，等.PCR-SSP基因分型技術在ABO疑難血型定型中的應用［J］.現代檢驗醫學雜志，2011，26（4）：53-55.

［15］張萍.羊水血型物質測定與臨床應用［J］.醫學創新研究，2008，5（12）：159-160.

Detection of amniotic fluid ABH blood group substances and ABO blood type gene classification＊

ChenJiang，LuXinmin，GuoYu，HuWei
（DepartmentofLaboratory，YibinMunicipalSecondPeople′sHospital，Yibin，Sichuan644000，China）

ObjectiveTo detect amniotic fluid ABH blood group substances and ABO blood group genotype by the polymerase chain reaction with sequence-specific primers（PCR-SSP）to increase the prenatal diagnosis of fetal ABO blood group.Methods53 pregnant women with gestational age 16－25weeks were selected.Amniotic fluid was extracted for detecting ABH blood group substances by the serological indirect agglutinating reaction；the amniotic fluid cells were separated for extracting DNA.Then the PCR-SSP technique was adopted to analyze the ABO blood group genotypes.Results16specimens of amniotic fluid were non-secreting type phenotype（30.2%）and 37specimens of amniotic fluid were secreting type phenotype（69.8%）；48specimens of amniotic fluid were detected out the ABO blood group genotype by the PCR-SSP method.ABO blood group of fetal amniotic fluid cells by the gene identification was consistent to the detection results of amniotic fluid secreting type ABH blood group substances.ConclusionThe PCR-SSP technique can accurately detect the fetal amniotic fluid cells ABO blood group.

ABO blood-group system；amniotic fluid；cell；polymerase chain reaction with sequence specific primes；ABH blood group substances

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.11.008

A

1671-8348（2014）11-1302-02

四川省衛生廳資助項目（20100583）；宜賓市科技局資助項目（2010SF011）。

陳江（1974－），副主任技師，碩士研究生，主要從事分子生物學與流式細胞學研究。

2013-09-28

2013-12-22）

論著·臨床研究