花生根乙醇提取物對大鼠前列腺增生抑制作用及對Bcl-2,Bax蛋白表達影響的研究

閆學紅,羅曉冰,卑占宇△,馬永超

(1.河南省漯河市召陵區人民醫院,河南漯河 462002;2.漯河醫學高等專科學校藥學系,河南漯河 462002)

花生根乙醇提取物對大鼠前列腺增生抑制作用及對Bcl-2,Bax蛋白表達影響的研究

閆學紅1,羅曉冰2,卑占宇2△,馬永超2

(1.河南省漯河市召陵區人民醫院,河南漯河 462002;2.漯河醫學高等專科學校藥學系,河南漯河 462002)

目的探討花生根乙醇提取物對丙酸睪酮(TP)誘導未去勢成年大鼠前列腺增生的抑制作用及其機制?方法 將60只SD大鼠隨機分為對照組?模型組及花生根乙醇提取物高?中?低劑量治療組,其中對照組大鼠正常喂飼,不用藥;模型組及各治療組皮下注射TP 5mL?kg-1?d-1,高?中?低劑量治療組同時灌胃不同劑量的花生根乙醇提取物(劑量分別為10mL?kg-1?d-1?5mL?kg-1?d-1?1mL?kg-1?d-1),連續14d?各組均于第15d處死,取前列腺?精囊和睪丸組織并稱重,計算各腺體指數[腺體濕質量(mg)/體質量(g)];采用免疫組織化學法檢測各組大鼠前列腺組織Bcl-2和Bax蛋白的表達?結果花生根乙醇提取物高?中劑量治療組與模型組比較,前列腺指數差異均有統計學意義(P0.01);低劑量組與模型組比較,差異無統計學意義(P0.05),花生根乙醇提取物抑制前列腺增生作用具有量效關系?花生根乙醇提取物高?中?低劑量組與模型組比較,睪丸指數?精囊指數?體質量變化差異無統計學意義(P0.05)?花生根乙醇提取物高?中?低劑量治療組Bcl-2和Bax蛋白表達率與模型組比較,差異有統計學意義(P0.05);與對照組Bcl-2和Bax蛋白表達比較,差異無統計學意義(P0.05)?結論花生根乙醇提取物具有良好的抑制前列腺增生作用,其機制可能是通過調節凋亡基因的Bcl-2和Bax蛋白比例平衡關系,促進良性前列腺增生(BPH)的細胞凋亡達到治療的效果?

植物提取物;花生根;前列腺增生;大鼠;細胞凋亡;Bcl-2;Bax

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是老年男性常見疾病?多發病,隨著全球人口的老齡化,其發病率不斷增高?迄今為止,BPH的發病機制尚不完全清楚[1]?有研究認為,BPH的發生除與增殖基因?凋亡基因及抗凋亡基因的異常表達有關之外?很可能還與雄?雌激素的失衡和各種生長因子的相互作用有關[2]?老年人雄激素水平下降后抗凋亡基因Bcl-2的高表達致使前列腺細胞凋亡下降很可能是發生BPH的主要因素[2]?目前,手術治療BPH療效顯著,但給患者造成一定的損傷?尋求藥物治療,特別是植物藥治療,以其注重整體?治補兼具?不良反應小?療效穩定持久的優勢備受人們的關注?民間有“單方一味——花生根”中藥單方治愈男性前列腺肥大,效果良好[3]?本文探討花生根乙醇提取物對大鼠前列腺增生抑制作用及對前列腺組織Bcl-2和Bax蛋白表達的影響,現報道如下?

1 材料與方法

1.1 材料 (1)花生根乙醇提取物的制備:將剛剛采收后棄置田間的新鮮花生根(采自贛州市贛縣)洗凈晾干粉碎,取500g,加體積分數60%的乙醇1 000mL作為提取劑,煮沸回流30min,冷卻抽濾,得到濾液?濾液經減壓蒸餾回收乙醇,得無醇味的濃縮提取物?提取物加雙蒸水至50mL使藥液(灌胃時注意震蕩搖勻)相當于生藥10.0g/mL,置冰箱中備用?(2)試驗動物:雄性SD大鼠60只,體質量180～200g,SPF級,由江西中醫學院動物中心提供?(3)藥物與試劑:丙酸睪酮(TP)注射液25mg/mL,購自上海通用藥業股份有限公司?羊抗兔SABC試劑盒?DAB顯色試劑盒,兔抗大鼠Bcl-2及Bax單克隆抗體,由武漢博士德生物工程有限公司提供?

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 將大鼠按體質量隨機分為5組,即對照組?模型組及花生根乙醇提取物高?中?低劑量治療組,每組12只?對照組:正常喂飼,不用藥?模型組及各治療組大鼠皮下注射TP 5mL?kg-1?d-1,每周3次(周一?三?五),連續14d?治療組于模型第1天起開始給藥,灌飼花生根乙醇提取物(高?中?低劑量組給藥劑量分別為:10mL?kg-1?d-1?5mL?kg-1?d-1?1mL?kg-1?d-1)?模型組第15天禁食10h,各組動物予過量的苯巴比妥鈉(100mg/kg)處死,分離大鼠前列腺?精囊腺和睪丸組織,分別用分析天平稱取各組織濕質量,計算前列腺?睪丸?精囊腺指數[腺體濕質量(mg)/體質量(g)]?

1.2.2 Bcl-2及Bax蛋白檢測 稱重完畢后迅速將前列腺組織固定于4%多聚甲醛溶液中,石蠟包埋,切片,厚4μm,嚴格按照試劑盒說明進行免疫組織化學法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達?醫學真彩色計算機圖像全自動分析處理系統(HPIAS-1000型)觀察并計算陽性細胞?顯微鏡下,前列腺組織中上皮細胞層中有棕黃色顆粒者為陽性細胞,每張切片中隨機選擇10個視野,計算Bcl-2及Bax蛋白的光密度,然后進行數字處理,計算平均光密度?

1.3 統計學處理 所有數據采用SPSS12.0統計軟件進行分析,計量資料采用±s表示,組間比較采用t檢驗,檢驗水準α=0.05,以P0.05為差異有統計學意義?

2 結 果

2.1各組大鼠前列腺濕質量及指數比較 與對照組比較,模型組前列腺濕質量及指數增大,差異有統計學意義(P0.01);與模型組比較,花生根乙醇提取物高?中劑量治療組前列腺質量及指數明顯降低,差異有統計學意義(P0.01)?各組大鼠前列腺濕質量及指數比較,見表1?

表1 各組大鼠前列腺濕質量及指數比較(±s)

表1 各組大鼠前列腺濕質量及指數比較(±s)

a:P 0.01,與模型組比較?

組別 n 前列腺濕質量(mg) 前列腺指數對照組 12 962.00±16.00a 3.62±0.56a模型組 12 1 665.00±24.00 6.48±0.48低劑量治療組 12 1 647.00±26.00 6.29±0.46中劑量治療組 12 1 153.00±18.00a 4.37±0.73a高劑量治療組 12 1 136.00±23.00a 4.24±0.35a

2.2 各組大鼠精囊腺濕質量及指數比較 模型組精囊指數較對照組增大,差異有統計學意義(P0.01)?花生根乙醇提取物各劑量治療組精囊腺指數與模型組比較,差異無統計學意義(P0.05),見表2?

2.3 各組大鼠睪丸濕質量及指數比較 花生根乙醇提取物各劑量治療組?模型組和對照組的睪丸濕質量和指數比較,差異無統計學意義(P0.05),見表3?

表2 各組大鼠精囊腺濕質量及指數比較(±s)

表2 各組大鼠精囊腺濕質量及指數比較(±s)

a:P 0.01,與模型組相比?

組別 n 精囊腺濕質量(mg) 精囊腺指數對照組 12 1 218.00±34.00a 4.66±0.48a模型組 12 2 012.00±50.00 7.86±0.32低劑量治療組 12 1 978.00±42.00 7.36±0.23中劑量治療組 12 2 044.00±36.00 7.69±0.42高劑量治療組12 2 088.00±43.00 7.78±0.45

表3 各組大鼠睪丸濕質量及指數比較(±s)

表3 各組大鼠睪丸濕質量及指數比較(±s)

組別 n 睪丸濕質量(mg) 睪丸指數對照組12 3 035.00±42.00 11.42±1.86模型組 12 3 012.00±49.00 11.36±1.79低劑量治療組 12 3 025.00±48.00 11.46±1.89中劑量治療組 12 3 042.00±45.00 11.55±1.78高劑量治療組12 3 040.00±46.00 11.48±1.86

2.4 各組大鼠干預前?后體質量比較 花生根乙醇提取物各劑量治療組大鼠體質量增長正常,與模型組?對照組比較,差異無統計學意義(P0.05),見表4?

表4 各組大鼠干預前?后體質量比較(±s)

表4 各組大鼠干預前?后體質量比較(±s)

組別 n 干預前體質量(g)干預后體質量(g)體質量變化率(%)對照組12 191.46±7.28 266.38±20.60 39.18±12.28模型組 12 191.64±10.02 266.86±18.88 38.24±10.85低劑量治療組 12 189.46±8.65 262.43±19.22 38.16±11.34中劑量治療組 12 190.47±7.86 264.77±21.06 39.12±12.06高劑量治療組12 191.07±11.01 268.46±21.25 40.08±10.04

2.5 各組大鼠前列腺組織Bcl-2和Bax蛋白表達率比較 對照組大鼠前列腺組織中上皮細胞層Bcl-2蛋白有弱陽性表達,模型組有較強陽性表達,高?中劑量治療組為弱陽性表達,高劑量組最弱,與對照組接近?對照組Bax蛋白上皮細胞層有較強陽性表達,而模型組表達最弱,高?中劑量治療組陽性表達強于模型組,高劑量組陽性表達最強,接近對照組,見表5?

表5 各組大鼠前列腺組織Bcl-2和Bax表達率比較(±s)

表5 各組大鼠前列腺組織Bcl-2和Bax表達率比較(±s)

a:P0.05,b:P 0.01,與模型組比較?

組別 n Bcl-2(%) Bax(%) Bcl-2/Bax對照組 12 7.98±1.45b 11.46±2.88b 0.86±0.44b模型組 12 13.25±2.86 8.23±2.42 1.48±0.52低劑量治療組 12 11.86±2.64a 8.48±2.62a1.26±0.36a中劑量治療組 12 8.24±1.36b 10.84±2.68b 1.08±0.34b高劑量治療組 12 8.03±1.26b 11.25±2.48b 0.90±0.24b

3 討 論

建立BPH模型必須具備睪丸存在和年齡增長兩個重要條件[4]?花生根乙醇提取物高?中劑量治療組的前列腺指數較模型組減少,顯示花生根乙醇提取物能抑制TP所致大鼠前列腺增生;但花生根乙醇提取物低劑量治療組其前列腺指數與模型組比較,差異無統計學意義(P0.05),未見有抑制前列腺增生作用?花生根乙醇提取物抑制前列腺增生作用具有量效關系?花生根乙醇提取物各劑量治療組?模型組和對照組大鼠的精囊腺?睪丸濕質量和指數比較,差異無統計學意義(P0.05),說明花生根乙醇提取物和TP對大鼠精囊腺?睪丸生長無明顯影響?花生根乙醇提取物各劑量治療組大鼠體質量增長正常,與模型組?對照組比較,差異無統計學意義(P0.05),說明花生根乙醇提取物對大鼠體質量無明顯影響?

Bcl-2及Bax基因在Bcl-2基因家族中是極重要的成員?通過轉基因動物和基因轉染實驗研究發現,Bcl-2基因對細胞凋亡具有明顯的抑制作用[5]?張學軍等[6]運用轉基因技術培育出Bcl-2前列腺組織特異性轉基因小鼠,該小鼠前列腺組織過量表達Bcl-2蛋白,并伴有前列腺增生的病理學改變?Bcl-2蛋白在轉基因鼠的前列腺體內的過量表達,能夠引發前列腺良性增生[6]?Kyprianou等[7]也發現 Bcl-2蛋白在前列腺增生組織中表達較前列腺正常組織中明顯升高?Bcl-2是程序性細胞凋亡的抑制基因,有研究表明,人BPH的組織標本中Bcl-2蛋白的表達明顯增加[8]?

細胞的增殖和死亡保持動態平衡是保證器官細胞總數目衡定的前提?正常前列腺的大小得以保持衡定也是由增殖的細胞數目和凋亡的細胞數目相當所決定?BPH時各種因子的表達水平發生改變,使這一平衡被打破,表現為細胞的復制增加或細胞的凋亡數目減少,從而引起總的細胞數目增加,導致前列腺體積的增大[9]?

Bax和Bcl-2蛋白的作用完全相反,Bax蛋白具有對抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用?有研究發現,Bcl-2/Bax蛋白之間比例是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素,因此Bax是極重要的促細胞凋亡基因[9]?細胞凋亡(apoptosis)亦稱為細胞程序死亡(programmed cell death)是一種選擇性的生理死亡,在正常組織中,細胞增殖速率和細胞死亡速率間存在著平衡,一旦不平衡發生,無論是通過細胞復制速率的增加還是細胞死亡速率的減少,其結果都是前列腺細胞的大量堆積及與之相應的前列腺的生長[10]?細胞的增殖與凋亡在前列腺的發生?發展中均有重要的地位,抑制細胞凋亡因子Bcl-2是內源性抑制劑,能防止細胞凋亡,該因子的過量表達可促使前列腺增生組織中細胞凋亡減少?增殖速率增加與凋亡速率減緩最終的結果都是造成前列腺內細胞絕對數目的增加,從而形成BPH?因此,BPH的產生與Bax和Bcl-2蛋白有很重要的關系?

綜上所述,花生根乙醇提取物對前列腺增生有明顯的治療作用,治療組睪丸?精囊及體質量與對照組相比無明顯影響?免疫組織化學結果檢測顯示,模型組Bcl-2表達率顯著高于對照組,Bax表達率顯著低于對照組,表明前列腺增生是由前列腺組織中Bcl-2和Bax調控失衡所致,灌服花生根乙醇提取物后,Bcl-2和Bax恢復到正常水平,使 Bcl-2/Bax比值恢復至平衡狀態,說明花生根乙醇提取物可通過調節凋亡基因的平衡而抑制前列腺的增生?

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Inhibiting effect of ethanol extract from peanut root on rat prostate hyperplasia andits influence on Bcl-2 and Bax protein

,, ,
(1.,,462002,;2.,,,462002,)

ObjectiveTo explore the inhibitory effect of the ethanol extract from peanut root on the non-castration adult rat prostate hyperplasia induced by testosterone propionate and its mechanism.Methods60SD rats were randomly divided into the control,model and high,middle and low dose of peanut root ethanol extract treatment groups,among them,the control group was normally fed without medication;the model group was subcutaneously injected by testosterone propionate(TP,5mL/kg/d)and simultaneously gavaged subcutaneous injection with peanut root ethanol extract(10mL/kg/d,5mLg/kg/d or 1mL/kg/d)for successive 14d.The rats in various groups were killed on 15dand their prostate,spermatophore and testicle tissues were separated and weighed.The ratio of gland/body-weight(mg/g)was calculated.The expressions of Bcl-2and Bax proteins in the prostate tissues were detected by immunohistochemistry.ResultsThere was statistical difference in the indexes of prostate between the treatment groups(high and middle dose)and the model group(P0.01),while there was no statistical difference between the low dose group and the model group(P0.05).This result showed that there was a dose-effect relationship between the inhibition effect on rat prostate hyperplasia and the ethanol extracts from peanut root.There was no statistical differences between the model group and the treatment groups in the indexes of testicle,spermatophore or the change of weight(P0.05).There was statistical difference between the control group or model group and the treatment group in the expression of Bcl-2or Bax protein(P0.05),while no statistical difference between the treatment group and the control group(P0.05).ConclusionEthanol extract from peanut root has good inhibiting effect on prostate hyperplasia and its mechanism could reach the curative effect by regulating the balance relation between apoptosis gene Bcl-2and Bax protein proportion and promoting apopitosis of benign prostatic hyperplasia.

plant extracts;peanut root;prostatic hyperplasia;rats;apoptosis;Bcl-2;Bax

10.3969/j.issn.1671-8348.2014.11.020

A

1671-8348(2014)11-1338-03

閆學紅(1968-),副主任藥師,本科,主要從事中藥制劑和中藥藥理研究?△

,Tel:15803953817;E-mail:beizhanyu@sina.com?

2013-10-23

2013-12-10)

論著?臨床研究