pEGFP-N1-UCH-L1重組質粒的構建

盧 豪,龐 偉,徐 婷,楊紅澎,奚用勇,黃承鈺,蔣與剛

泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1,UCH-L1)是腦內含量最為豐富的蛋白之一,約占腦內可溶性蛋白的2%。它作為一種去泛素化酶,參與泛素的再循環,調節泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system,UPS)的蛋白降解功能[1-2]。它最初是作為一種神經元特異性蛋白被發現的,被命名為蛋白基因產物9.5(protein gene product 9.5,PGP9.5)。UCH-L1的作用主要表現在三個方面：(1)泛素水解酶活性:單體形式下,UCH-L1催化泛素C末端酯基和氨基的水解,通過這種途徑,UCH -L1能循環使用泛素分子,這對于細胞中蛋白的降解至關重要[3]。(2)泛素連接酶活性:二聚體形式下,UCH-L1的連接酶活性以α泛素核蛋白作為底物,以賴氨酸63為連接點形成泛素鏈,這使得底物免受蛋白酶體系統的降解,從而維持底物的穩定性[4]。(3)單體穩定效應:大量泛素單體與UCH-L1緊密連接,可阻止泛素單體在腦中的降解[5]。 在前期研究中,我們通過蛋白質組學技術發現缺鋅可引起大鼠海馬UCH-L1表達下調、電壓門控陰離子通道-1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)表達上調,并通過原代海馬神經細胞培養實驗得到驗證[6-7]。因此推測,缺鋅引起的學習記憶能力損傷可能與UCH-L1水平降低[8]、VDAC1水平上升相關聯。為了深入研究UCH-L1在缺鋅致認知功能損傷中的作用機制,我們首先選用pEGFP-N1質粒構建UCH-L1基因重組表達載體,取得陽性克隆,命名為pEGFP-N1-UCH-L1重組質粒并進行鑒定,為進一步通過細胞轉染實驗探討UCH-L1在神經退行性疾病機制中的作用奠定基礎,同時也為VDAC1的深入研究進行技術儲備。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：新生第1～3 d的Wistar乳鼠,由天津醫科大學實驗動物中心提供[許可證號：SYXK(津)2009-0001]。Trizol 試劑、瓊脂糖購自Invitrogen 公司；TakaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)、DNA Ligation Kit Ver.2.0、DNA Ligation Kit、BglⅡ限制酶和SalⅠ限制酶均購自大連TaKaRa公司；DH5α感受態細胞、TIANgel Midi Purification Kit購自北京天根公司；EZgeneTMEndoFree ezFlow Plasmid Miniprep Kit購自美國Biomiga公司；pEGFP-N1質粒由軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所全軍軍事應激醫學重點實驗室劉曉華教授饋贈。

1.2引物設計 根據UCH-L1基因(GenBank NM_017237)信息添加酶切位點(BglⅡ,SalⅠ),設計擴增引物,上游引物序列：5' GCCAGATCTATGCAGCTGAAACCGATGG 3'；下游引物序列：5' ACGCGTCGACGCGGCTGCTTTGCAGAGAGC 3'。引物由大連寶生物公司合成。

1.3UCH-L1基因的擴增 用Trizol試劑提取Wistar乳鼠腦組織總RNA,逆轉錄PCR擴增UCH-L1基因。反應體系為：10×one step RNA PCR Buffer 5 μl,MgCl2(25 mM) 10 μl,dNTP混合物(各10 mM)5 μl,RNase抑制劑(40 U/μl)1 μl,AMV RTase XL(5 U/μl)1 μl,AMV-Optimized Taq(5 U/μl)1 μl,上游引物(20 μM)1 μl,下游引物(20 μM)1 μl,上樣量1 μl,補足RNase Free dH2O至50 μl。反應條件為：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個循環；72 ℃ 7 min。

1.4pEGFP-N1-UCH-L1重組質粒的構建 回收純化基因擴增產物,與pEGFP-N1載體分別經Bgl Ⅱ、Sal Ⅰ酶切,再回收純化UCH-L1基因及pEGFP-N1載體片段,經T載體16 ℃反應30 min,連接產物轉化DH5α感受態細胞,涂布于含50 μg/ml卡那霉素的LB平板,于37 ℃培養 12～16 h,挑取單一的菌落擴增培養。提取質粒由北京華大基因公司測序。

2 結果

2.1UCH-L1基因的擴增結果 提取的RNA通過RT-PCR反應及瓊脂糖電泳分離,如圖1所示獲得了預期的約700 bp片段,并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收 DNA片段。

圖1 RT-PCR擴增UCH-L1基因

2.2質粒和目的DNA 基因片段的雙酶切結果 將目的DNA基因片段和pEGFP-N1質粒同時進行雙酶切,電泳結果見圖2。從凝膠回收目的片段,然后進行連接反應,轉化DH5α感受態細胞,鋪板,于37 ℃培養12～16 h,挑取單一的菌落擴增培養,提取質粒進行測序分析。

圖2 pEGFP-N1質粒和UCH-L1基因片段雙酶切產物的瓊脂糖電泳圖

2.3質粒測序鑒定結果 圖3為質粒測序結果,通過Blast搜索,證明就是我們所克隆的UCH-L1基因。結果表明,已成功構建了pEGFP-N1-UCH-L1重組質粒。

圖3 pEGFP-N1-UCH-L1質粒序列圖

3 討論

UCH-L1屬于泛素蛋白酶體系統中的泛素羧基端水解酶家族,分布于腦、睪丸、卵巢、腎臟、腫瘤等組織,經由泛素相關途徑行使對細胞分化、增生和凋亡的調節功能。UCH-L1在大腦中的表達要遠遠高于睪丸、卵巢、腎臟等組織,與腦功能密切相關。UCH-L1在神經元內廣泛表達,已觀察到海馬神經元胞體和樹突內均有分布,以維持海馬神經元的正常突觸結構和功能[9-10]。而且研究發現,UCH-L1對于維持正常的突觸功能和學習記憶能力是必需的,恢復UCH-L1水平,可逆轉β淀粉樣蛋白處理的海馬腦片和阿爾茨海默病模型小鼠海馬腦片的突觸傳遞功能障礙,并且給予外源性UCH-L1可改善模型小鼠的認知功能[11-12]。在胚胎的發育中,UCH-L1已經分布于未分化的中樞神經和周圍神經。研究表明,UCH-L1通過與單體泛素的相互作用,來調控神經元前體細胞的形態和分化,從而證明了UCH-L1在神經系統中的重要地位[13]。在成熟神經元中,UCH-L1仍然有很高的表達。

作為UPS中一種重要的酶,UCH-L1在阿爾茨海默病、帕金森癥等神經退行性疾病發生及發展中的重要作用日益受到關注,但眾多的環節與機制尚不清楚,有待于開展更深、更細致的研究。而pEGFP-N1-UCH-L1重組質粒的成功構建,為轉染原代培養海馬神經細胞,促進UCH-L1的表達,進一步研究該基因在缺鋅致認知功能損傷中的作用機制提供了有力載體。

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