大白菜FAD8基因的轉錄調控研究

劉春香,潘 爽,薛 瀚,劉福

(濰坊學院 山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室,山東 濰坊 261061)

FAD8基因是1994年在擬南芥中首次發現的，功能是催化二烯脂肪酸(亞油酸和棕櫚二烯酸)轉變為三烯脂肪酸(TAs，亞麻酸和棕櫚三烯酸)[1]；FAD8是一個在質體中表達的脂肪酸去飽和酶，相同功能的酶在擬南芥中共發現3個，FAD3[2]、FAD7[3]和FAD8，其中FAD7和FAD8的表達部位都是質體，主要影響類囊體膜脂的組成，在擬南芥中FAD8的表達表現出低溫誘導特性，被稱為低溫誘導的脂肪酸去飽和酶[1]。FAD8除了與低溫有關外，還參與的茉莉酸[4]、ABA和SA[5](水楊酸)介導的抗病防御反應，在煙草中的FAD8還表現出抗干旱脅迫的功能[6]，玉米的FAD8還表現出鹽脅迫的抗性[7]。

大白菜對低溫有較強的抗性，我們關注并克隆了BcFAD8(Bc代表大白菜)基因[8]，其是否在抗低溫過程中顯示了重要功能呢？另外，植物抵抗低溫的重要特征是膜脂不飽和度的增加[9]，膜脂去飽和的分子機制主要是脂肪酸去飽和酶調節的，該家族的酶又受一系列因素的調控[10]，BcFAD8又受哪些因素調控呢？為此，我們對大白菜進行了低溫處理，分析BcFAD8的表達，令筆者不解的是，多次的低溫處理并沒有檢測出溫度與BcFAD8轉錄水平變化的相關性，其表達與低溫誘導無關嗎？為解決這一疑問，我們對BcFAD8上游的啟動子及調控序列進行轉錄因子結合元件分析，并通過實時熒光定量PCR檢測BcFAD8的表達，來探究該基因的表達模式，為進一步研究其在逆境中的生理功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 大白菜的低溫處理及電導率、葉綠素熒光參數測定

在秋季進行大白菜播種，先在無草苫覆蓋的日光溫室內盆栽培養約2個月，到冬季達到蓮座期轉移到室內，適應幾天后放入培養箱內進行變溫處理。將大白菜分為2組(以20 ℃)為起點，一組從20 ℃開始降溫，分別在15 ℃、10 ℃、5 ℃、0 ℃下進行培養；另一組從20 ℃開始升溫，分別在25 ℃、30 ℃下進行培養。每個溫度下培養3 d(光照16 h，黑暗8 h)，然后取生長旺盛的葉片，每個處理3次重復，按照陳建勛等[11]的煮沸法測定電導率，并計算相對電導率。葉綠素熒光參數采用德國PAM2100葉綠素熒光儀測定，樣品處理方法與電導率測定時的處理方法相同，測定前先對葉片進行30 min的暗適應，分別對Fmin(最小熒光值)、Fmax(最大熒光值)進行測定，每個處理3次重復。

1.2 PCR引物設計及基因克隆

BcFAD8基因在Genebank上的登錄號為AY894813.2，通過序列特異性比對，選擇特異性序列區段，設計用于表達定量的PCR引物，上游引物P-s1：GGGTTGGACTTTGTGAC，下游引物為P-a1：GCCTTGTTTGTTACAGTC，擴增序列位于終止密碼子前。內參為大白菜β-actin基因，其上游引物為actin-ps：CACTTCTCCTCCTTCTTTGG，下游引物為actin-pa：TAGGCATCCTT CTGGTTCA。引物由生工生物技術服務有限公司合成。根據BcFAD8上游序列和大白菜基因組的Bac克隆 KBrH034G13序列，設計引物，上游引物P1 CAACCCAAAACGAGAACAGT，下游引物P2位于BcFAD8基因起始密碼子附近，序列為TCACCAATCTAGCACTATCACTG，擴增目的片段長度1 069 bp，PCR擴增程序為預變性94 ℃、8 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、80 s，30個循環，后延伸72 ℃、5 min，擴增產物用1%瓊脂糖電泳，目的片段采用天根的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，并克隆到pMD18-T載體上，陽性克隆送山東省農業科學院測序中心進行測序。

1.3 BcFAD8基因的半定量PCR表達部位檢測分析

基因表達組織特異性半定量PCR樣品為冬季溫室內生長正常的大白菜根、莖、葉，采用Trizol法提取總RNA，用快速核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度，做反轉錄模板，RNA量每管1 μg，反轉錄總體積10 μL。為選擇適當的循環數，對擴增22、24、26、27、28個循環的產物分別進行電泳檢測，最終確定為28個循環。內參基因和BcFAD8基因表達檢測的反應程序均為94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，51 ℃、30 s，72 ℃、30 s，28個循環，采用20 μL的反應體系。擴增后的產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.4 BcFAD8基因的實時熒光定量檢測

對培養20 d左右生長正常的大白菜樣品進行低溫處理，起點溫度為25 ℃；每隔3 h變化1次溫度，溫度間隔5 ℃，降到5 ℃以后，再以5 ℃為起點，同樣的方式升高到25 ℃。采用TaKara公司的RNAiso Plus試劑盒提取葉片總RNA，反轉錄采用TaKara公司的反轉錄試劑盒，每樣品反轉錄1 μg總RNA，PCR反應時每管取1 μL，內參和目的基因同時做定量PCR，重復3次，反應體系25 μL，循環40個，引物同半定量PCR，反應程序94 ℃、 2 min，94 ℃、30 s，51 ℃、30 s，72 ℃、30 s，采用伯樂熒光定量PCR儀，用SYBR Green Ⅰ檢測體系，相對定量2-△△CT方法，系統自動計算表達量差異并生成基因表達差異圖。

1.5 BcFAD8基因的啟動子及調控序列分析

利用PlantCARE軟件( http:/ /bioinformatics.psb.ugent.be /webtools /plantcare /html /) 對BcFAD8的啟動子區進行分析，標出各種類型的順式作用元件。

1.6 黑暗光照、ABA、SA處理后BcFAD8基因的熒光定量檢測

對大白菜兩葉一心期的幼苗進行處理：(1)在培養箱內遮光黑暗處理2 d，見光1.5 h后取樣；(2)正常見光大白菜葉面噴施100 μmol/L的SA，分別于1.5 h、3 h后取樣；(3)正常見光大白菜葉面噴施100 μmol/L的ABA，1.5 h、3 h后取樣。對所取的新鮮葉片進行液氮短期保存，并提取總RNA，進行熒光定量PCR分析，方法同上。

2 結果與分析

2.1 低溫處理后大白菜葉片電導率的變化

電導率是反應細胞膜完整性的參數，測得的變溫處理的大白菜葉片的相對電導率變化見圖1。從圖1可知，經過低溫環境培養的大白菜，進行不同溫度的處理，相對電導率0 ℃時最低，大白菜的膜基本未見損傷，隨著溫度的升高，大白菜膜的滲透性變大，電導率在常溫下較高，30 ℃高溫下膜的損傷較大，滲透性明顯升高，相對電導率達24%以上。

圖1 變溫處理大白菜葉片相對電導率變化

2.2 低溫處理后大白菜葉片葉綠素熒光參數的變化

Fmin是反應葉綠體不能進行光化學反應的熒光值，該值的升高代表不用于光合作用的光能增多，正常狀態下Fmin值越小越好，而Fmax值表示用于光合作用的最大光化學效率，Fmax值越大越好，在逆境下往往因光合器官受損Fmin值升高，Fmax值下降。本研究從20 ℃到0 ℃的降溫處理過程中，Fmax值未見明顯變化，Fmin值也基本未升高，說明0 ℃及以上低溫對葉綠體功能未造成損傷(見圖2，圖中F為相對值)；而從20 ℃到30 ℃的升溫過程中，大白菜的Fmin值變化不大，Fmax值明顯降低，說明高溫對大白菜葉綠體有一定的損傷。從大白菜葉片整體生長狀況也可以得知，30 ℃下生長幾天后葉片開始變黃，其他溫度下都基本保持深綠色。

圖2 變溫下大白菜葉片Fmin和Fmax值的變化

從電導率變化和葉綠素熒光參數變化可知,高溫下葉綠體受到了一定損傷，低溫下則沒有，說明大白菜葉綠體對低溫具有適應性。

2.3 BcFAD8基因表達的組織特異性

用半定量RT-PCR方法對BcFAD8基因在大白菜不同器官的表達進行了分析(見圖3)。結果表明，BcFAD8基因在大白菜莖、葉中表達，以葉中的表達亮度最高，在根中基本不表達，說明該基因在綠色組織里表達。

圖3 BcFAD8在不同器官中的表達

2.4 低溫處理下BcFAD8基因的熒光定量分析

低溫處理下BcFAD8基因的熒光定量結果見圖4。從圖4可以看出，溫度升高處理時，各溫度處理間沒有明確的變化趨勢，表達量最大差異0.68倍，這一差異在基因表達水平上是較小的；溫度降低處理時，各溫度下BcFAD8基因的表達也沒有明顯差異，表達量差異最大1.07倍，與系統誤差的水平相當，而且表達變化沒有規律，25 ℃和5 ℃基本保持相當的水平，說明基因表達量沒有隨著溫度的下降而升高，BcFAD8基因表達的平均水平均高于β-actin基因表達的平均水平。

圖4 低溫處理下BcFAD8基因的熒光定量分析

2.5 BcFAD8基因啟動子克隆及調控序列的元件分析

為確定大白菜基因組的 KBrH034G13克隆中含有BcFAD8的啟動子區域，確保起始密碼子上游沒有內含子間隔，我們通過PCR擴增了從起始密碼子到-1 061處的序列,見圖5。結果表明，獲得了大于1 kb的目的片段，經克隆測序，通過序列比對證明得到的序列與KBrH034G13的序列一致。說明可以利用KBrH034G13的信息分析BcFAD8的啟動子序列。

對BcFAD8基因起始密碼子上游1 500 bp范圍內的表達元件分析，可以發現除了啟動子起始必須的TATA框、起始子和CAAT框以外，該基因還有多個表達調控元件(見表1)。由于功能與葉綠體膜脂有關，故含有多個光響應元件，共13個。還有脅迫應答元件5個，生物鐘元件3個，激素響應元件4種8個。此外，未標注的還有5個胚乳表達相關元件和一些蛋白因子結合位點，以及一些功能未報道的元件，未發現溫度響應元件。基因表達的調控是復雜的，僅從元件分析并不能準確證實各種因素可以誘導該基因的表達。

圖5 BcFAD8啟動子區的PCR擴增

表1 BcFAD8基因啟動子上游的主要順式作用元件

表1(續)

2.6 部分啟動子調控元件的有效性驗證

采用熒光定量PCR對幾個代表性元件進行檢驗，結果見圖6。當大白菜從黑暗轉到光照1.5 h后，葉中FAD8基因表達上調12.5倍，說明光照能夠誘導該基因的大量表達。水楊酸(SA)對基因的誘導有延遲效應，在處理1.5 h后基因表達量有所增加，與對照(CK)相比并不明顯，表達上調1.2倍；但在處理3 h后，基因表達量明顯增加，3 h處理與對照的表達差異為4.7倍。ABA對大白菜葉片的FAD8表達的影響效果明顯，在噴施ABA1.5 h后，基因表達量明顯增加，與對照的表達差異為12.2倍，處理3 h后比對照增加12.6倍，說明ABA對BcFAD8的誘導快；而SA誘導具有延遲效應。從上述結果可知，光照、SA、ABA對BcFAD8都有誘導表達的效應，說明元件分析的結果在實驗分析中能夠得到證實，BcFAD8基因受多種信號調控。

3 討論

從本研究的結果看，大白菜對0 ℃以上的低溫是適應的，膜系統并未產生損傷；相反，在溫度逐漸升高的過程中，表現出了相對電導率的升高，葉片變黃，說明在適應一段時間的低溫后，0 ℃及0 ℃以上的低溫不會損傷大白菜膜系統。Routaboul J M等[12]的研究表明，植物體內類囊體膜含有的TAs比其他部位高，生長在22 ℃的擬南芥含有約70%的類囊體TAs，大白菜可能也是由于類囊體膜TAs含量高導致其低溫耐受性。Vijayan P(2002)[13]報道降低類囊體膜脂不飽和度會產生光抑制，類囊體膜上的TA對低溫下解除光系統II失活是必須的。本實驗低溫下大白菜葉片保持深綠色，生長良好，Fmin和Fmax參數均處于最佳狀態，推測其葉綠體膜系統有較高的TAs水平，應該具有較高的FAD酶活性。本研究低溫處理并沒有提高BcFAD8的表達水平，這與Falcone D L[14]、Shah S[15]、Gibson S等[4]對擬南芥的報道，Berberich T[8]對玉米的報道不一致，可能FAD8本身的轉錄水平已經足夠高了，或者存在其他低溫誘導表達的同功能FAD基因代償了FAD8，也可能存在轉錄后水平的調控。ángela Román[16]報導大豆的FAD3B的轉錄不受低溫誘導，且高溫下存在蛋白降解水平的調控。

圖6 熒光定量PCR對BcFAD8基因經光照、水楊酸處理和ABA處理后的檢驗結果

膜脂隨溫度升高，飽和度升高是適應溫度的必要調控[17]，那么如何通過降低ω-3脂肪酸去飽和酶來降低TAs的含量呢？擬南芥的FAD8蛋白存在熱不穩定的44個氨基酸的碳端結構，溫度升高后會加速酶蛋白的降解[2]，BcFAD8在轉錄水平基本不受溫度影響，可能與擬南芥FAD8一樣，存在轉錄后蛋白降解水平的調控。

對于高溫下BcFAD8也能正常表達，我們推斷TAs對植物的作用遠不止是膜不飽和度的增加。Routaboul J M[12]發現長期在高溫下缺乏TAs植物也會死亡，膜脂中一定比例的TAs是必需的。TAs中的亞麻酸是茉莉酸的合成前體[5,18]，與維生素E代謝有關[19]，有清除活性氧的生理作用[20]。因此要維持質體中一定水平的TAs含量，必須保證FAD8或同功能基因持續表達。

基因的表達受各種因素誘導調控，因此在基因的啟動子上游必然存在相應的調控元件，本研究分析了BcFAD8的調控元件，發現該基因受光照、激素、逆境等多種因素誘導，說明該基因的轉錄水平調控是復雜的。本研究發現，黑暗下BcFAD8轉錄水平很低，光照可明顯提高BcFAD8的表達水平，這與大豆FAD8有相同的調控機制[21]。根中不表達可能是因為根不見光，或不含葉綠體。SA和ABA處理也提高了BcFAD8的表達，與啟動子元件預測的結果相同。且前人的報道也證實該基因與植物抗性[8]有關，關系到SA[22]、ABA[12，20]等信號的調控。我們在啟動子序列分析中沒有發現低溫響應元件，結合表達定量分析結果，我們認為BcFAD8不是低溫誘導后轉錄水平升高的基因，對于喜冷涼的物種，大白菜可能一直保持較高的BcFAD8轉錄水平，其響應環境高溫可能存在轉錄后水平的調控。

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