125I測定低水平P-選擇素平面位點密度新方法

凌穎琛，李趣歡，黃 冰，張金赫，方 穎

(1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣州軍區廣州總醫院 核醫學科，廣東 廣州 510010)

在感染部位或毒性刺激下，血液中的循環白細胞黏附在內皮細胞表面并遷移進入內皮下組織，從而實現殺滅病原體及組織修復的作用[1]。P-選擇素為選擇素家族中的一員，它通過與配體PSGL-1(P-selectin glycoprotein ligand)的相互作用，介導白細胞的初始拴縛(tether)和隨后的滾動粘附(rolling)過程[2]。通常，人們利用平行平板流動腔(parallel plate flow chamber，PPFC)實驗來體外模擬循環白細胞黏附，并測定黏附分子間的二維反應動力學參數[3-5]。在流動腔實驗中，細胞流經鋪有一定密度的P-選擇素底板，并與之發生相互作用。二維逆反應速率可通過初始拴縛實驗直接測量單分子鍵的生存時間(lifetime)而得到；分子間的正反應速率與受體、配體的濃度、細胞接觸面積、分子擴散等因素相關[5-6]。因此，準確測定流動腔底部P-選擇素的位點密度，是在分子水平上采用流動腔實驗系統研究選擇素介導的細胞黏附事件的關鍵的第一步。

1 放射性標記法與SPECT簡介

通過熒光或125I放射性標記的方法，可獲得細胞表面PSGL-1的位點密度。已有文獻報道了白細胞和HL-60細胞表面的PSGL-1分子個數分別為11 000±2 000和18 000±2 000[7]，其位點密度分別為49 sities/μm2和36 sites/μm2。然而，P-選擇素鋪于流動腔底部平面的玻璃板上，單黏附分子鍵介導的瞬時黏附實驗要求位點密度小于10 sites/μm2[8]，以致熒光檢測方法的靈敏度難以滿足實驗要求；雖然125I放射性標記的敏感度較高，但傳統的計數器一般只用于探測獨立試管中溶液的放射量，而非一個平面或蓋玻片上的放射量。

Infinia Hawkeye 4 ECT是一款多功能核素成像設備，它能執行單光子發射計算機斷層掃描(single photon emisson computer Tomography，SPECT)，是集SPECT/PET/CT三位一體的多功能分子影像設備，能完成100%的SPECT和90%的PET/CT功能，可進行影像的ECT和CT同機融合定位以及全能量范圍核素衰減校正等功能[9]，而且它還可同時對不同濃度的多個樣品進行檢測，大大縮短檢測所需時間。因此，在本研究中，采用125I放射性標記方法，利用SPECT儀器，對平面吸附的P-選擇素進行位點密度測定。通過對物理吸附于玻璃及聚苯乙烯(Polystyrene，PS)的P-選擇素的位點密度進行測定，發現P-選擇素的位點密度與吸附濃度呈線性關系，在玻璃上的吸附效率略高于聚苯乙烯；普通物理吸附后的P-選擇素的方向是隨機的，只有大約10%的P-選擇素呈現易于與細胞表面PSGL-1結合的朝向，即結合位點暴露的頭部向上。

2 材料與方法

2.1 IODOGEN法標記蛋白

實驗中用于標記的蛋白有人類P-選擇素/Fc嵌合體和鼠抗人P-選擇素單克隆抗體9E1，均購自R&D system Inc，MN。進行碘化反應時，將40 ～ 150 μg蛋白(按150 kDa的IgG分量計算，106 kDa的P-選擇素嵌合體則為30～100 μg)溶解在100 μL的Tris緩沖液(25 mmol Tris-HCl，pH 7.5，0.4 mol NaCl)中，置于帶蓋的EP管中。在pierce pre-coated iodination tube(購自Thermo Fisher Scientific Inc，IL)中加入1 mL的Tris緩沖液，潤濕后倒掉，之后將100 μL高濃度Tris緩沖液(0.125 mol Tris-HCl，pH 6.8，0.15 mol NaCl)直接加入Iodination Tube的底部，并防止讓溶液接觸試管管壁。在通風櫥中，將10 μL(1.0 μCi)的Na125I加入到iodination tube中，室溫活化6 min，每30 s旋轉試管1次。將活化后的碘化物加入到蛋白溶液中，室溫反應6～9 min，每30 s輕輕晃動試管1次。最后，加入50 μL終止反應溶液(含10 g/L酪氨酸的Tris緩沖液，pH 7.4)，混合并孵育5 min，在1 min和4 min時輕輕晃動試管1次。

2.2 標記蛋白純化

實驗前，用20 mL的Tris緩沖液對10 mL葡聚糖凝膠G-25填充的層析柱進行沖洗和平衡。將碘化反應的產物加入層析柱中，用Tris緩沖液對層析柱進行洗脫，每0.5～0.8 mL收集1管，共收集25管。用Infinia Hawkeye 4 ECT和Pierce BCA蛋白定量試劑盒(thermo fisher scientific inc，IL)分別測定放射量和蛋白量的比值。

2.3 測定P-選擇素吸附的位點密度

研究中使用的吸附表面有聚苯乙烯(PS)和玻璃兩種，其中以Costar 48-孔板(corning inc，NY)作為PS吸附材料，將玻璃蓋玻片用玻璃膠固定在6-孔板內作為玻璃吸附材料。在2 mm厚的硅膠墊上裁剪8 mm×8 mm的正方形孔洞，讓其緊貼在玻璃蓋玻片上作為P-選擇素吸附的區域。將130 μL(48-孔板)或102 μL(6-孔板)不同濃度的P-選擇素或125I標記的P-選擇素加入到吸附材料中，4 ℃下孵育16 h。將溶液吸出后，用含1%的牛血清白蛋白(BSA)的Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)洗3次，再加入1%的BSA HBSS，室溫下孵育1 h。若吸附的是帶標記的P-選擇素，此時用SPECT進行放射性檢測。若吸附的不是帶標記的P-選擇素，應將溶液吸出，再加入125I標記的P-選擇素抗體，室溫下孵育30 min。最后將溶液吸出，用1%的BSA HBSS洗3次，加入1%的BSA HBSS防止干燥，用SPECT進行放射性檢測。若吸附材料為玻璃時，SPECT檢測前需先將硅膠墊圈取出，防止結果受到硅膠吸附的影響。

2.4 SPECT放射性檢測

將樣品放置在GE Infinia Hawkeye 4的檢測平臺上對125I進行放射性檢測。標記蛋白的層析樣品檢測時間一般為10 min，位點密度的檢測時間按實際樣品的放射量調整，約20～30 min。樣品檢測完畢后，對每個樣品孔的放射量用配套軟件進行具體分析。

3 結果

3.1 P-選擇素和P-選擇素抗體分子的標記

利用Iodogen法對人類P-選擇素分子及鼠抗人P-選擇素抗體9E1進行125I放射性標記，之后通過葡聚糖凝膠G-25層析獲得標記蛋白洗脫液。圖1(a)和圖2(a)分別為SPECT上顯示的檢測圖像，25管層析洗脫液按順序放置在檢測平臺上，灰度代表放射性，顏色越深即代表放射性越強，每管所對應的放射性計數如圖1(b)和圖2(b)所示，圖中橫坐標為管編號(洗脫順序)。兩種樣品的洗脫都大致呈現了2個峰，第1個峰為蛋白峰，大致在3～5號試管間，此后放射性大大減弱，之后又呈現一個比較寬而平緩的峰，為游離峰。2個峰之間的分界線比較明顯，說明蛋白和游離125I的分離是比較成功的，標記蛋白的純度較高。另一方面，第1個峰的峰值遠高于第2個峰，說明了蛋白的標記是比較成功的，大部分的125I已經標記到目標蛋白上，只有少量的125I呈游離狀態。

圖1 葡聚糖凝膠G-25層析分離純化125I標記P-選擇素

圖2 葡聚糖凝膠G-25層析分離純化P-選擇素抗體

3.2 P-選擇素分子在玻璃和PS上的吸附

為了對P-選擇素進行標準化定量，需對收集純化后的標記蛋白其進行蛋白定量，并計算出每個蛋白分子每秒的放射性計數。在實驗中，我們收集到125I標記的P-選擇素共5 mL，每秒鐘的總放射量計數為63.61。利用Pierce BCA蛋白微量定量試劑盒測得其蛋白質量濃度為1.003 mg/L，按照P-選擇素/Fc嵌合體分子量為106 kDa進行計算，純化所得的每個125I標記的P-選擇素分子每秒鐘的放射性計數為2.23×10-12。

將125I標記P-選擇素進行梯度稀釋后，分別滴加到面積為8 mm×8 mm的玻璃上，4 ℃下吸附16 h。用含1%的BSA的HBSS清洗3次后在SPECT上進行放射性檢測。圖3(a)中顯示的是SPECT檢測20 min后的放射性計數圖片，可看到隨著P-選擇素質量濃度的增加，125I標記P-選擇素的吸附量也隨之增加，放射性計數與P-選擇素質量濃度之間呈線性關系(見圖3(b))。在流動腔實驗當中，HL-60細胞在P-選擇素上進行初始拴縛(tether)和stop-go簡單兩步滾動(rolling)的P-選擇素吸附濃度分別為30 μg/L和500 μg/L。根據P-選擇素溶液濃度與位點密度(見圖3(e))的關系，可計算出HL-60細胞初始黏附的P-選擇素的位點密度為99 sites/μm2，而HL-60細胞兩步滾動的位點密度則為1 662 sites/μm2。

圖4為測得的P-選擇素分子在PS材質上吸附結果。對應于細胞初始拴縛和滾動黏附的P-選擇素質量濃度，其位點密度分別為69 sites/μm2和1140 sites/μm2，二者均低于P-選擇素在玻璃材質上的吸附密度。二因素方差分析表明，這種影響十分顯著(P=0.000 3?0.01)，即P-選擇素分子在玻璃上的吸附要優于在PS材質上的吸附。

3.3 125I標記的P-選擇素抗體分子檢測P-選擇素的吸附

已經知道P-選擇素與其主要配體PSGL-1結合的部位位于N-端頭部的lectin結構域上[10]。而在流動腔實驗當中，需要根據有效的P-選擇素位點密度來對分子反應動力學參數進行計算。由于普通的物理吸附的隨機性，P-選擇素并非均能呈現易于與其配體分子結合的朝向，而只有那些頭部結合位點曝露、能與配體發生相互作用的分子才是真正需要考察的對象。然而，以上實驗結果測定的是直接標記P-選擇素所得的位點密度，即位點密度當中包含了各種朝向的P-選擇素。為了獲得有效P-選擇素的位點密度，我們對P-選擇素胞外區單克隆抗體9E1進行125I標記，然后使標記抗體與預先物理黏附在玻璃底板上的P-選擇素結合，顯然只有結合位點曝露在外的P-選擇素才能與標記抗體結合，因此，最后測定的是有效P-選擇素的位點密度。

圖3 P-選擇素在玻璃上的吸附結果

圖4 P-選擇素在PS上的吸附結果

用Iodogen法對9E1進行125I標記，收集純化后的標記蛋白并對其進行蛋白定量。在實驗中，收集到125I標記的9E1共6.2 mL，每秒鐘的總放射量計數為138.53。利用Pierce BCA蛋白定量試劑盒測得其蛋白濃度為16.625 mg/L，按照IgG分子量為150 kDa進行計算，純化所得的每個125I標記的9E1分子每秒鐘的放射性計數為2.07 × 10-12。

將不同濃度(0～1 μg/L)的P-選擇素分別滴加到面積為8 mm×8 mm的玻璃片上，4 ℃下吸附16 h。用含1%的BSA的HBSS洗3次后，加入125I標記的單克隆抗體9E1，室溫下孵育30 min。將溶液吸出，再用1%的BSA HBSS洗3次，用SPECT進行放射性檢測，結果見圖5。由圖5(a)(25 min后的放射性計數圖片)可知，隨著P-選擇素質量濃度的增加，125I-9E1的結合量也隨之增加，P-選擇素質量濃度與放射量、位點密度之間均為線性遞增關系(見圖5(b)、5(c))。介導HL-60細胞初始拴縛(30 μg/L)和滾動黏附(500 μg/L)的P-選擇素濃度對應的位點密度分別為9 sites/μm2和148 sites/μm2。這2個值都遠低于直接標記P-選擇素所測得的位點密度(99 sites/μm2和1662 sites/μm2)。已有文獻利用CRD序列的特異性抗體和熒光檢測相結合的方法對不同吸附方式的P-選擇素位點密度進行測定，發現位點密度的結果與P-選擇素吸附后的分子朝向有密切聯系[11]。因而，以上測定的實驗結果說明了通過物理吸附吸附在載玻片上的P-選擇素的方向是隨機分布的，且頭部位點暴露的P-選擇素只為全部P-選擇素的十分之一左右。

4 結束語

圖5通過抗體結合測定P-選擇素在玻璃上吸附結果

流動腔實驗當中，準確測定底板上蛋白分子的位點密度是進一步通過模型計算其二維反應動力學參數的前提和重要保障。例如，通過平行平板流動腔實驗測定HL-60細胞表面的PSGL-1與流動腔底板P-選擇素之間的正反應速率就必須用到分子位點密度的數據。

綜上所述，通過125I標記與SPECT檢測相結合的方法測定平面內蛋白分子的位點密度是切實可行的新方法，對比傳統的計數器檢測方法可以更為快速直觀的獲得數據，且彌補了其不能測量平面的缺陷。新方法所測量的數據能夠與平行平板流動腔實驗相結合測得二維分子動力學的一系列參數，這將會為炎癥、血栓等與細胞黏附相關疾病機理的明晰提供一定的幫助。

[1] McEver R P.P-selectin and PSGL-1:exploiting connections between inflammation and venous thrombosis[J].Thromb Haemost，2002,87(3):364-365.

[2] Ley K，Bullard D C，Arbones M L，et al.Sequential contribution of L-and P-selectin to leukocyte rolling in vivo[J].J Exp Med，1995，181(2):669-675.

[3] Li Q，Fang Y，Ding X，et al.Force-dependent bond dissociation govern rolling of HL-60 cells through E-selectin[J].Exp Cell Res，2012,318(14):1649-1658.

[4] Mehta P，Cummings R D，McEver R P.Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1[J].J Biol Chem，1998,273(49):32506-32513.

[5] Huang J，Chen J，Chesla S E，et al.Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics[J].J Biol Chem，2004,279(43):44915-44923.

[6] Thoumine O，Kocian P，Kottelat A，et al.Short-term binding of fibroblasts to fibronectin:optical tweezers experiments and probabilistic analysis[J].Eur Biophys J，2000,29(6):398-408.

[7] Skinner M P，Lucas C M，Burns GF，et al.GMP-140 binding to neutrophils is inhibited by sulfated glycans[J].J Biol Chem，1991,266(9):5371-5374.

[8] Alon R，Hammer D A，Springer T A.Lifetime of the P-selectin-carbohydrate bond and its response to tensile force in hydrodynamic flow[J].Nature，1995,374(6522):539-542.

[9] 黃熙.GE Infinia VC Hawkeye 的原理簡介及維修實例[J].醫療衛生裝備，2011,32(8):137-138.

[10] Ushiyama S，Laue T M，Moore K L，et al.Structureal and functional characterization of monomerica soluble P-selectin and comparison with membrane P-selectin[J].J Biol Chem，1993,268(20):15229-15237.

[11] Lee D，King M R.Microcontact printing of P-selectin increases the rate of neutrophil recruitment under shear flow[J].Biotechnol Prog，2008,24(5):1052-1059.