單細胞測序技術(shù)在腫瘤基礎(chǔ)研究中的應用＊

陳 誠，楊 軍綜述，董 堅△審校

（1.昆明醫(yī)科大學第一臨床學院，昆明650031；2.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，昆明650032）

隨著人類基因組計劃（human genome project，HGP）和國際人類基因組單體型圖計劃（the international HapMap project）的完成以及高通量生物芯片技術(shù)的成功研發(fā)，以全基因組測序為目標的基因組結(jié)構(gòu)初步分析已經(jīng)完成。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤是在細胞水平的惡性克隆，同時，惡性腫瘤細胞通過對自身的不斷的“改良”以適應宿主各種環(huán)境。從進化上來說，能夠引發(fā)惡性腫瘤的細胞即所謂“成功”的腫瘤細胞，其具備將遺傳模板傳遞給下一代腫瘤細胞的能力，而能夠引致遠處轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤細胞其自身必定帶有其他腫瘤細胞亞群所不具備的信息。因此，在單克隆水平去分析這些腫瘤克隆的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等，有可能揭示惡性腫瘤產(chǎn)生的具體機制。由于惡性腫瘤本身的異質(zhì)性，在原發(fā)灶的腫瘤細胞群可能是由具備血管生成、侵襲能力、轉(zhuǎn)移特性等不同方面的能力或是具備多功能的細胞亞群所組成。目前普遍認為，傾向于發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的一些細胞亞群在親代腫瘤中已然存在，不同的轉(zhuǎn)移灶可從不同的單個細胞增生而來，并且這些發(fā)生轉(zhuǎn)移的細胞亞群受多重機制的調(diào)控。如果能夠以單個細胞進行整個全基因組范圍的分析，不僅取材更經(jīng)濟，更重要的是細胞可能達到真正的純化，實驗所得結(jié)果更精確也更可靠。因此，探索單個腫瘤細胞的遺傳信息并對其進行分析成為腫瘤基礎(chǔ)研究人員的夢想。

2011年，由紐約冷泉港實驗室、德州大學安德森癌癥研究中心開發(fā)并報道單細胞測序技術(shù)（single cell sequencing，SNS），該技術(shù)能夠突破傳統(tǒng)癌癥基因組研究的如混合樣品測序無法判斷具體突變來源及頻率，無法解釋癌癥的發(fā)生、發(fā)展以及演化過程中的細節(jié)，難以區(qū)分主動與被動突變；細胞系測序無法除去體外培養(yǎng)時產(chǎn)生的新突變等問題[1]。目前，對于惡性腫瘤單細胞測序已應用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎癌、血液腫瘤等惡性腫瘤的發(fā)病機制等的研究，同時，也有研究者將該技術(shù)應用于乳腺癌轉(zhuǎn)移機制方面的研究[2-4]。將單細胞的純化技術(shù)聯(lián)合單細胞測序技術(shù)應用于腫瘤的相關(guān)機制研究必將能夠取得突破性進展。

1 單細胞測序技術(shù)的原理

單細胞測序主要包括單細胞基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序，通過對單個細胞內(nèi)的DNA和RNA進行序列分析，分別揭示單個細胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組的變化情況。單細胞全基因組測序是對選定的目的細胞的全部基因組序列進行非選擇性、均勻擴增，隨后利用外顯子捕獲技術(shù)進而高通量測序。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序是利用高通量測序技術(shù)進行cDNA測序，從而獲取特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本，主要用于在全基因組范圍內(nèi)挖掘基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，尤其適用于存在高度異質(zhì)性的干細胞及胚胎發(fā)育早期的細胞群體。與活細胞成像系統(tǒng)相結(jié)合，單細胞轉(zhuǎn)錄組分析更有助于深入理解細胞分化、細胞重編程及轉(zhuǎn)分化等過程及相關(guān)的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

2 單細胞分離技術(shù)

2.1 單細胞分離的重要性 既往關(guān)于腫瘤的相關(guān)機制的研究中，研究樣本主要來源于在體外培養(yǎng)的腫瘤細胞系以及患者的腫瘤標本。由于樣本采集及單細胞分離技術(shù)受限的原因，幾乎所有的癌癥基因組研究結(jié)果都來自包含多種不同細胞群（包括腫瘤細胞及其他正常細胞亞群等）的腫瘤樣本，混雜的細胞中摻雜許多干擾信號，導致目標腫瘤細胞亞群內(nèi)那些包含有與腫瘤發(fā)生、浸潤或轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號可能被平均化甚至被無限稀釋。為了盡可能的獲得單個細胞用于腫瘤基因組學研究，研究人員開展了一系列的細胞純化技術(shù)并進行優(yōu)化。目前，對于單細胞的分離技術(shù)主要兩大類：（1）基于細胞培養(yǎng)以達到單個細胞分離的目的；（2）分離技術(shù)是基于儀器的單個細胞的分選。

2.2 基于培養(yǎng)的方法 （1）有限稀釋法：主要是針對腫瘤細胞系進行單個腫瘤細胞的分選，將細胞配制成系列濃度梯度的細胞懸液，接種于96孔板等培養(yǎng)器皿中，從而使某些孔中只有1個細胞。由于操作費時，且無法保證對單個腫瘤細胞的分離和純化，因此，不能大規(guī)模開展。（2）軟瓊脂培養(yǎng)法：其主要應用于新鮮采集的腫瘤標本內(nèi)單個腫瘤細胞的篩選，利用實體瘤細胞能在軟瓊脂上生長并形成克隆的原理，可將少量的腫瘤細胞從大多數(shù)非惡性細胞內(nèi)分離出來。目前，由Cell Biolabs公司的開發(fā)的克隆原性腫瘤細胞分離試劑盒（clonogenic tumor cell isolation kit，CytoSelect）能夠?qū)蝹€腫瘤細胞進行分離純化，達到單細胞分離的需求。

2.3 基于儀器分選的方法 （1）單細胞顯微操作法：利用玻璃針頭等在高倍鏡下進行細胞分選，該方法獲取細胞數(shù)量少，且操作難度大、易損傷目的細胞，因此難以應用于大規(guī)模實驗研究中。（2）流式細胞儀分選細胞：通過超聲波使樣本細胞團分散成單個細胞，使帶不同電荷的細胞經(jīng)過電場偏向不同方向，或是通過熒光標記目的細胞進行分選，從而達到分選以及獲取單個細胞的目的，該技術(shù)分離迅速，純度高。（3）激光捕獲顯微切割：在組織切片上覆蓋一層透明的膜，顯微鏡下選擇目的細胞后，利用脈沖式紅外激光束使膜熔化，冷卻后該位置的細胞牢固地黏附在膜上面，從而實現(xiàn)細胞分離，利用該方法可方便、確定分離靶細胞。（4）免疫磁珠分離：其原理是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，與磁珠相連的帶有表面抗原的細胞被吸附而滯留在磁場中，不能與磁珠連接著的細胞不在磁場中停留，從而使目的細胞得以分離。這是目前最為常用的循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）富集方法，現(xiàn)已有FDA批準上市的專業(yè)產(chǎn)品Cell SearchTM System （Veridex）。

3 單細胞測序技術(shù)在腫瘤相關(guān)基礎(chǔ)研究中的應用

3.1 腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的研究 2008年，Ley等[5]利用流式細胞分選技術(shù)分選出AML患者的腫瘤細胞，隨后對這些腫瘤細胞進行了遺傳突變檢測，發(fā)現(xiàn)了可能與AML有關(guān)的基因；2009年，Tang等[6]分析了單個小鼠細胞的四細胞胚胎和卵母細胞的轉(zhuǎn)錄組，同年，Mayer等[7]通過激光顯微切割技術(shù)分離單個的外周血淋巴細胞，然后對一類少見的遺傳性大腸癌--家族性腺瘤性息肉綜合征的致病基因APC基因進行了測序分析，獲得了完整的APC基因突變數(shù)據(jù)。2010年，Clark等[2]及Pleasance等[8]分別對膠質(zhì)瘤細胞系U87及小細胞肺癌細胞系NCI-H209進行了的單個腫瘤細胞測序分析，研究所得結(jié)果為腫瘤的基因診斷提供了新的線索；2011年Hannemann等[9]采用高分辨率微陣列比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）技術(shù)，通過顯微切割技術(shù)分離出單個的結(jié)腸癌細胞系HCT116的細胞，隨后對這些細胞進行了拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）的檢測。最新的研究結(jié)果顯示，通過利用單細胞測序技術(shù)所進行的深度測序可發(fā)現(xiàn)許多非常罕見的與人大腸癌發(fā)生的密切相關(guān)的突變。2011年，Bass等[10]通過對9名的大腸癌患者進行了全基因組的測序，得出了如VTI1A和TCF7L2的融合等11個讀碼框內(nèi)的基因融合事件。2012年，Hou等[4]采用以 MDA為基礎(chǔ)的單細胞測序技術(shù)對原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）患者的單個骨髓細胞進行了測序并分析，篩查出在ET發(fā)病和進展中的驅(qū)動基因。隨后，該研究團隊用同樣的方法分析了單個腎癌細胞的單核苷酸突變特征[3]。

3.2 腫瘤轉(zhuǎn)移機制的研究 通過單細胞測序技術(shù)分析來自同一患者成對的腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶的樣品中的單個腫瘤細胞的基因組信息，對比原癌巢腫瘤細胞與轉(zhuǎn)移腫瘤細胞之間突變位點，從而闡明腫瘤的轉(zhuǎn)移及浸潤遺傳學機制，可以認識各種腫瘤細胞之間及個體之間存在差異的起因和解釋腫瘤產(chǎn)生的機制[11-12]。2010年，Ding等[13]完成了來源于同一患者的4種組織樣本的DNA樣本的完整序列分析，結(jié)果證實轉(zhuǎn)移腫瘤來源于原發(fā)性腫瘤中1個亞類的細胞，與原發(fā)灶內(nèi)的細胞相比，轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的細胞已發(fā)生突變。2011年，Navin等[1]利用全基因組擴增及DNA測序?qū)?00個乳腺癌細胞分別進行了CNV的分析，準確地量化出單個核基因組中的拷貝數(shù)，推斷出乳腺癌細胞的群體結(jié)構(gòu)和腫瘤的進化過程[2]。通過對100個源于多染色體組腫瘤的單細胞進行分析，發(fā)現(xiàn)了3個不同的與腫瘤細胞連續(xù)克隆擴增有關(guān)的細胞亞群。接著又對100個源于單染色體組腫瘤的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的單細胞進行分析后，得出腫瘤的播散和轉(zhuǎn)移與單個克隆擴增有關(guān)。他們還發(fā)現(xiàn)了一種不會發(fā)生轉(zhuǎn)移的含有豐富亞群的假二倍體細胞。

3.3 腫瘤干細胞的研究 Liu等[14]通過運用單細胞分離技術(shù)所取得的單個腫瘤干細胞接種于特定的培養(yǎng)基培養(yǎng)，進行單細胞克隆形成分析，觀察腫瘤干細胞的自我更新及分化潛能。對來源于同一乳腺癌細胞系的腫瘤干細胞進行分析發(fā)現(xiàn)，單克隆形成細胞比部分克隆及多克隆形成細胞具有更高的增殖潛能，提示單克隆形成細胞中可能含有腫瘤干細胞的亞群體。他們通過對單個腫瘤干細胞的測序研究發(fā)現(xiàn)CD133（＋）的高表達和腫瘤血管生成的密切關(guān)系可能與三陰乳腺癌的進展復發(fā)有關(guān)。Felthaus等[15]利用單細胞測序技術(shù)對口腔鱗狀細胞癌的干細胞研究發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細胞癌對常規(guī)放化療的抵抗可能由腫瘤干細胞引起。

4 單細胞測序技術(shù)在腫瘤臨床治療方面的應用

4.1 指導腫瘤的治療 由于單染色體組腫瘤的患者要比多染色體組腫瘤患者有更好的化療敏感性和更高的生存率，這提高了發(fā)現(xiàn)研究耐藥克隆的可能性，單細胞測序可以提高原發(fā)腫瘤中比較罕見的耐藥性克隆的檢測靈敏度[16]。這一方法可能會解釋耐藥性克隆是在原發(fā)性腫瘤中先天存在還是在治療后出現(xiàn)這一問題[17-18]。此外，通過對1個患者數(shù)以百萬計的單個腫瘤細胞進行分析，可以繪制出腫瘤在接受輔助治療前后的全基因組多樣性圖譜。這樣的研究在順鉑治療宮頸癌和卵巢癌放化療中已經(jīng)開始進行，這些研究通過分析腫瘤基因組化療前和化療后的基因拷貝數(shù)，檢測到一些腫瘤的異質(zhì)性及預先存在于原發(fā)性腫瘤的亞群在化療后進一步擴大[19-20]。利用單細胞測序技術(shù)來進行單個細胞的基因組拷貝數(shù)分析可以提供更全面的基因組信息，一些潛在的癌基因可能會被發(fā)現(xiàn)，從而為腫瘤的治療提供更好的決策指導。

4.2 評估腫瘤的預后 單細胞測序技術(shù)的一個主要應用是它可以檢測那些在組織樣本中比較罕見的，少于100個細胞數(shù)的腫瘤細胞。例如只有5%～10%的早期乳腺癌會進展為浸潤性癌，所以用傳統(tǒng)的檢測手段無法檢測。免疫組織化學發(fā)現(xiàn)，許多早期乳腺癌就可以表現(xiàn)出很明顯的腫瘤異質(zhì)性，利用單細胞測序技術(shù)來監(jiān)測這些腫瘤的異質(zhì)性，相應的檢測結(jié)果可提示患者的預后，從而可能會對這些腫瘤是否會發(fā)展為浸潤性癌提供預測并更好地對腫瘤的治療進行指導[21]。

4.3 監(jiān)測腫瘤的復發(fā) 單細胞測序的另一臨床應用是在監(jiān)測和分析轉(zhuǎn)移性腫瘤治療過程中的循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）。Bidard等[21]對115例確診為轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者化療前及化療后隨訪36個月都進行了血液中CTCs的檢測，23%的患者可以檢測到循環(huán)腫瘤細胞，有10%的患者在7.5mL血液中可以檢測到1個以上的循環(huán)腫瘤細胞。其結(jié)果提示化療前CTCs的檢測可以作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌遠傳轉(zhuǎn)移無進展生存期和總生存期的一個獨立預后因素。Rao等[22]對轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的循環(huán)腫瘤細胞的檢測也提示了CTCs與黑色素瘤的預后及生存率有關(guān)。臨床醫(yī)生在患者接受輔助治療或化療后通過監(jiān)測循環(huán)腫瘤細胞來確定腫瘤是否有復發(fā)的可能。

5 展 望

2011年《自然方法》雜志將單細胞測序列為年度值得期待的技術(shù)之一，2013年《科學》雜志將單細胞測序列為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首。雖然大部分的腫瘤組織樣本基因組學研究可以提供1個患者身上的總體突變趨勢，但不能確定是否所有的腫瘤細胞都包含全套的突變，或者不同的亞群是否包含這些突變的子集，并且聯(lián)合推動了腫瘤的進化和發(fā)展。而單細胞測序法向人們提供了探索腫瘤基因組多樣性和檢測分析罕見癌癥細胞基因組或腫瘤細胞亞群所包含的遺傳信息的手段和方法。同時，在基礎(chǔ)研究方面，它還揭示了部分腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的部分機制，并在腫瘤的早期診斷，指導臨床治療，提示預后復發(fā)等方面發(fā)揮了積極的作用。筆者相信，隨著單細胞分離技術(shù)以及單細胞基因組擴增技術(shù)的逐漸成熟，測序成本的大幅度下降，破譯來自單細胞的30億堿基的基因組并逐個細胞比較序列正在變?yōu)楝F(xiàn)實。

[1] Navin N，Kendall J，Troge J，et al.Tumor evolution in-ferred by single-cell sequencing[J].Nature，2011，472（7341）：90-94.

[2] Clark MJ，Homer N，Connor BD，et al.U87MG decoded：the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line[J].PLoS Genet，2010，6（1）：e1000832

[3] Xu X，Hou Y，Yin X，et al.Single-cell exome sequencing reveals single-nucleotide mutation characteristics of a kidney tumor[J].Cell，2012，148（5）：886-895.

[4] Hou Y，Song L，Zhu P，et al.Single-cell exome sequencing and monoclonal evolution of a JAK2-negative myeloproliferative neoplasm[J].Cell，2012，148（5）：873-885.

[5] Ley TJ，Mardis ER，Ding L，et al.DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome[J].Nature，2008，456（7218）：66-72.

[6] Tang F，Barbacioru C，Wang Z，et al.mRNA-Seq wholetranscriptome analysis of a single cell[J].Nat Methods，2009，6（5）：377-382.

[7] Mayer V，Schoen U，Holinski-Feder E，et al.Single cell analysis of mutations in the APC gene[J].Fetal Diagn T-her，2009，26（3）：148-156.

[8] Pleasance ED，F(xiàn)utreal PA，Campbell PJ，et al.A small-cell lung cancer genome with complex signatures of tobacco exposure[J].Nature，2010，463（7278）：184-274.

[9] Hannemann J，Meyer-Staeckling S，Kemming D，et al.Quantitative high-resolution genomic analysis of single cancer cells[J].PLoS One，2011，6（11）：e26362.

[10] Bass AJ，Lawrence MS，Brace LE，et al.Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2fusion[J].Nat Genet，2011，43（10）：964-968.

[11] Ehrich M，Turner J，Gibbs P，et al.Cytosine methylation profiling of cancer cell lines[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（12）：4844-4849.

[12] Pittet MJ，Grimm J，Berger CR，et al.In vivo imaging of T cell delivery to tumors after adoptive transfer therapy[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（30）：12457-12461.

[13] Ding L，Ellis MJ，Li S，et al.Genome remodelling in a basal-like breast cancer metastasis and xenograft[J].Nature，2010，464（7291）：989-990.

[14] Liu TJ，Sun BC，Zhao XL，et al.CD133（＋1）cells with cancer stem cell characteristics associates with vasculogenic mimicry in triple-negative breast cancer[J].On-cogene，2013，32（5）：544-553.

[15] Felthaus O，Ettl T，Gosau M，et al.Cancer stem cell-like cells from a single cell of oral squamous carcinoma cell lines[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，407（1）：28-33.

[16] Navin N，Hicks J.Future medical applications of single cell sequencing in cancer[J].Genome Med，2011，3（5）：31.

[17] Gerlinger M，Swanton C.How Darwinian models inform therapeutic failure initiated by clonal heterogeneity in cancer medicine[J].Br J Cancer 2010，103（8）：1139-1143.

[18] Merlo LM，Pepper JW，Reid BJ，et al.Cancer as an evolutionary and ecological process[J].Nat Rev Cancer，2006，6（12）：924-935.

[19] Cooke SL，Temple J，Macarthur S，et al.Intra-tumour genetic heterogeneity and poor chemoradiotherapy response in cervical cancer[J].Br J Cancer，2011，104（2）：361-368.

[20] Cooke SL，Ng CK，Melnyk N，et al.Genomic analysis of genetic heterogeneity and evolution in high-grade serous ovarian carcinoma[J].Oncogene，2010，29（35）：4905-4913.

[21] Bidard FC，Mathiot C，Delaloge S，et al.Single circulating tumor cell detection and overall survival in nonmetastatic breast cancer[J].Ann Oncol，2010，21（4）：729-733.

[22] Rao C，Bui T，Connelly M，et al.Circulating melanoma cells and survival in metastatic melanoma[J].Int J Oncol，2011，38（3）：755-760.