牛病毒性腹瀉病毒Real-time PCR方法的建立及其應用

張淑琴，譚斌，李鵬，楊勇，孫娜，王鳳雪，郭利，溫永俊，程世鵬

(中國農業科學院特產研究所特種經濟動物分子生物學國家重點實驗室，長春130112)

牛病毒性腹瀉/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的牛等動物的重要傳染病。受感染牛可表現出多種臨床癥狀，包括肺炎、腹瀉、流產、出血性綜合征等急性感染及持續性感染和黏膜病，同時，由于BVDV引起的免疫抑制可造成繼發感染和其他疫苗免疫失敗。據統計，在每100萬犢牛中，由于BVDV感染造成的損失可達2000～5700萬美元[1]。該病毒除感染牛外，還可以感染鹿、羊駝、牦牛、駱駝等特種動物，對特種經濟動物養殖危害較大。

BVDV基因組核酸為單股、正鏈RNA，長約12.3kb，由5′端非編碼區(5′UTR)、1個大的開放閱讀框(ORF)和3′端非編碼區(3′UTR)構成。大開放閱讀框序列編碼著所有的病毒蛋白，單個病毒蛋白的順序為Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2/3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B，多聚蛋白體形成后，經宿主細胞和病毒自身的多種蛋白酶進行翻譯和翻譯后加工，生成不同的病毒蛋白[2]。依據5′UTR基因序列可將牛病毒性腹瀉病毒分為2個基因型，即BVDV1和BVDV2[3]。最近，典型牛瘟病毒(包括Th/04KhonKaen virus，D32/00-‘HoBi’等)被定義為BVDV3型[4]。根據能否使細胞發生病變效應將BVDV分為致細胞病變型CP和非致細胞病變型NCP 2種生物型[5]。臨床上分離毒株多為非致細胞病變型。感染非致細胞病變型BVDV的小牛血清已成為生物制品生產中較大的威脅[4]。因此，快速準確地檢測BVDV成為預防和控制牛病毒性腹瀉的關鍵。常規檢測BVDV的技術主要有病毒分離、血清學試驗等。這些方法對于臨床上無細胞病變毒株的診斷在敏感性、特異性、時效性等方面都存在各自的缺陷。用于病毒核酸檢測的Real-time PCR技術以其快速、靈敏、特異性強等優點在基因表達水平的分析、病原體的定性和定量檢測等方面得到廣泛應用[6]。本研究建立了檢測BVDV的SYBR GreenⅠ Real-time PCR方法，并對臨床感染牛體內BVDV進行定量檢測，揭示病毒在宿主體內各臟器的分布情況。

1 材料和方法

1.1病毒

牛病毒性腹瀉病毒JL毒株(BVDV-1)、牛病毒性腹瀉病毒HEN03毒株(BVDV-2)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、牛副流感病毒(PI3V)、豬瘟病毒C株(CSFV-C)均由中國農業科學院特產研究所特種經濟動物分子生物學重點實驗室分離鑒定并保存。

1.2主要儀器和試劑

PCR儀、Bio-rad實時熒光定量PCR儀、ExTaq酶、pMD18-T載體(大連寶生物工程公司)，Trizol、反轉錄試劑盒(Invitrogen公司)，質粒提取與膠回收試劑盒(AXYGEN公司)。

1.3引物的設計與合成

通過序列比對，根據牛病毒性腹瀉病毒5′UTR基因保守序列，利用Oligo6.0軟件設計了1對引物。上游引物BF(5′ GGT AGC AAC AGT GGT GAG TTC 3′)，下游引物BR(5′ CTC AGG TTA AGA TGT GCT GTG 3′)，擴增片段136bp，引物由上海生物技術服務有限公司合成。

1.4病毒RNA提取和cDNA的合成

采用Trizol試劑提取病毒的RNA，提取步驟參照使用說明書進行。提取的RNA溶于30μL DEPC 處理的ddH2O，反轉錄按照Invitrogen反轉錄試劑盒說明進行。

1.5標準品的制備

利用“1.4”項下合成的牛病毒性腹瀉病毒cDNA作為模板進行常規PCR，反應體系25μL：cDNA模板2μL、上下游引物(10pmol)各1μL、dNTP(2.5mM)2μL、10×Ex Buffer 2.5μL、ExTaqTMDNA 聚合酶0.25μL、ddH2O 16.25μL。反應條件：95℃ 5min，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 20s，35個循環，最后72℃延伸7min。RT-PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的DNA片段連接pMD18-T載體轉化后挑單克隆提取質粒送測序，序列正確質粒利用紫外分光光度計測其D260nm和D280nm值，并計算出每微升拷貝數。

1.6SYBRGreenⅠreal-timePCR反應條件

將質粒標準品10倍倍比梯度稀釋，并進行Real-time PCR反應，反應體系按照SYBR Premix ExTaqTM(Perfect Real Time)試劑盒說明書進行，反應條件：95℃預變性10s；95℃ 5s，60℃ 20s，共40個循環，每個循環結束時檢測熒光信號。標準曲線的繪制及擴增產物的熔解曲線由實時熒光定量PCR儀自動進行。

1.7敏感性、特異性和重復性試驗

用牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛副流感病毒3型和豬瘟病毒的核酸進行實時熒光定量PCR檢測，以此確定該檢測方法的特異性；方法敏感性的檢測采用10倍倍比稀釋108copies/μL～101copies/μL的質粒標準品，確定檢測的最低濃度限。選擇2份牛病毒性腹瀉病毒1型(BVDV-JL)感染病料和1份牛病毒性腹瀉病毒2型(BVDV-HEN03)感染病料，提取病毒核酸并反轉錄成cDNA后，進行real-time PCR檢測，每個樣品重復3次，確定批內重復性。批間重復性是在同一反應條件下進行3次獨立的real-time PCR檢測。

1.8臨床病例主要臟器的病毒分布檢測

臨床病例的主要臟器樣品來源于分離BVDV-JL毒株的病死牛臟器[7]，主要包括脾臟、淋巴結、胸腺、腎臟、肝臟、肺臟和心臟等臟器。各臟器凍存于-70℃冰箱中。提取各臟器總RNA，通過Real-time PCR檢測各臟器病毒含量。

2 結果

2.1質粒濃度的計算

質粒濃度為12.7μg/μL，A260/A280為1.83，根據公式(6.02×1023copies/moL)×(濃度g/μL)/(MWg/moL)=copies/μL計算其拷貝為4.1×108copies/μL。

2.2標準曲線的建立

實時熒光定量PCR反應條件優化后結果顯示，BVDV的標準品具有良好的線性關系，相關系數R2為0.999，擴增效率E為95.9%(圖1)，熔解曲線為單一峰值，Tm值為85.5。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小為136bp左右

2.3熒光定量PCR的敏感性

Real-time PCR檢出的最低限為4.1×101copies/μL，常規PCR的檢測極限為4.1×103copies/μL(圖2)，其靈敏度為常規PCR的100倍左右。

2.4熒光定量PCR的特異性

熔解曲線結果表明，只有BVDV才能擴增出特異性峰，Tm值為85.5，而對其它牛源病毒(IBRV、BRSV、BPI3V)和豬瘟病毒(CSFV)檢測結果均為陰性(圖3)。

2.5熒光定量PCR的重復性

取3份不同病料，將提取的牛病毒性腹瀉病毒RNA反轉錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR檢測，統計分析表明，批內變異系數(CV)0.4%～0.8%，批間變異系數(CV)1.3%～2.2%(表1)。

表1Real-timePCR檢測3份不同病料的批內和批間重復檢測結果

Table 1Reproducibility of intra-and inter-assay of Real-time PCR

2.6臨床病料病毒檢測

對凍存于-70℃冰箱中臨床病料采用Real-time PCR方法檢測各臟器病毒含量。胸腺、淋巴結和脾臟的病毒含量最高，其中，胸腺的病毒含量為8.94×106copies/μL，肺臟、腎臟、心臟和肝臟也檢測到不同含量的病毒核酸，但在病毒分離中均未能夠分離到病毒。

3 討論

牛病毒性腹瀉/黏膜病呈世界性分布，給世界養牛業發展造成了巨大的經濟損失。隨著我國養牛業的迅速發展，目前已有20多個省、市、自治區存在該病。本研究前期流行病學調查表明，多數省份牛病毒性腹瀉病毒血清中和抗體陽性率高達70%。在我國，目前還沒有商品化的疫苗，因此診斷成為防治該病的重要措施。BVDV與CSFV同科同屬，在免疫學上存在著交叉性，臨床上豬感染BVDV癥狀與豬瘟類似，應用常規血清學方法很難將兩者區分。常規PCR檢測雖然較常規分離病毒相比靈敏度高，但由于檢測過程中需要進行電泳，容易污染。而Real-time PCR技術可以實時監測反應過程中的擴增產物，建立標準曲線后，可以準確定量病毒核酸的拷貝數，試驗結果無需再進行電泳評估，大大節省了試驗時間和反應的靈敏度[8]。

本試驗建立了牛病毒性腹瀉病毒實時熒光定量PCR檢測方法，該方法所建立的擴增曲線和標準曲線具有良好的線性關系(相關系數R2=0.999；擴增效率E=95.9%)，熔解曲線在40個循環內無引物二聚體等非特異性擴增，且與其它牛源病毒及豬瘟病毒不發生交叉反應，表明該方法具有高度的特異性；該方法可檢測到初始模板中4.1×101copies/μL的病毒核酸，其靈敏度為常規PCR的100倍；重復性試驗結果變異系數0.4%～2.2%，表明該方法具有很好的重復性。應用所建立的Real-time PCR方法檢測了臨床上牛病毒性腹瀉病毒感染牛各臟器病毒含量，胸腺、淋巴結和脾臟等淋巴組織中病毒含量最高，其中胸腺的病毒含量為8.94×106copies/μL；肺臟、腎臟、心臟和肝臟也檢測到不同含量的病毒核酸，但在病毒分離中均未能夠分離到病毒[7]。該結果表明，病毒主要侵害淋巴器官，此研究可為臨床病例選擇病理組織進行病毒分離提供依據。

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[7]張淑琴,郭利,武華,等.牛病毒性腹瀉病毒BVDV-JL株的分離鑒定[J].中國預防獸醫學報,2011,33(3):181-184.

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