人參須固態發酵中皂苷Rb2與Rb3的動態變化

閆梅霞，崔麗麗，許世泉，劉俊霞，王英平※

(1．中國農業科學院特產研究所，長春 130112； 2．吉林農業科技學院，吉林 吉林 132101)

雙向固態發酵又稱新型固體發酵，是指具有活性成分的藥性基質被藥用真菌發酵，它既能提供真菌所需營養大量生長菌體，同時又能因真菌的酶而改變其原來的成分，發酵具有雙向性，產品稱為藥性菌質[1]。人參是我國傳統名貴中藥，具有益氣補虛、安神降壓、益氣生津之功效?，F代藥理研究證實，人參皂苷是發揮其藥理作用的主要活性成分，人參皂苷Rb2、Rb3為原二醇型人參皂苷，對心肌缺血有保護作用[2]，二者組合物對大鼠急性心肌梗死有保護作用[3]，Rb3還具有降血糖，抗氧化等作用[4]。我國利用發酵法炮制中藥的歷史悠久，目前在用的片仔癀、六神曲[5]、半夏曲[6]等都是發酵中藥，且均為多菌種發酵，中藥通過發酵達到了減毒增效和增加新藥效的目的?，F代發酵技術的進步、藥用菌深層發酵研究、中藥藥理研究的深入為發酵中藥提供了研究基礎，中藥發酵研究越來越受到關注。添加中藥有效成分的液態發酵[7]、以中藥為添加物或底物的固態發酵[8]和復方中藥的發酵[9]均證實藥用菌能夠對中藥的藥效成分進行轉化。本研究對人參皂苷Rb2、Rb3在藥用菌赤芝固態發酵過程中含量動態變化進行研究，分析雙向固態發酵對人參藥效成分的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株

赤芝[Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Karst]由中國農業科學院特產研究所質量評價實驗室分離純化保藏。

1.2 培養質

試管、平板菌種培養基(復合PDA配方)；液體菌種培養基(PDB配方)；固體發酵培養基(人參須切段，輔料為純凈水，料∶水1∶2，121℃滅菌25min，制作為人參須發酵基質)。

1.3 發酵工藝

試管菌種平板復壯后制作液體菌種，液體菌種180r/min 24℃暗培養3d，然后轉接培養2級菌種，培養3d后接種于固體發酵基質，接種量10%。

1.4 發酵過程與樣品測定

于整個發酵培養過程的1d、2d、4d、6d、8d、10d、13d、16d、20d、24d、28d、32d進行觀察和取樣，滅菌后的基質為空白對照。樣品按1∶10(g/mL)加入甲醇，超聲30min，連續3次。超高效液相色譜儀測定，Rb2檢出限0.55、定量限為1.84；Rb3檢出限1.41、定量限4.70。

1.5 儀器與試劑

MJX-100B-Z霉菌培養箱(上海博訊實業有限公司)；LDZX-75KBS滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)；ACQUITY超高效液相色譜儀(Waters公司)；人參皂苷標準品Rb2和Rb3(四川維克奇生物科技有限公司)；其余試劑為分析純。

2 結果與分析

2.1 菌絲生長狀態分析

赤芝菌絲在人參須基質上生長，大約20d左右可以長滿整個基質，然后隨著培養時間的延長，大約30d左右觀察到基質出現缺水現象。菌絲在基質上生長時未見氣生菌絲旺盛的表現，也沒有出現厚菌膜(圖1)。

2.2 發酵過程中皂苷含量變化分析

赤芝雙向固態發酵對2種人參皂苷有轉化作用，發酵過程含量變化顯著。Rb2在發酵初期1d～2d含量顯著升高，2d～20d含量逐漸降低，20d時含量遠低于對照，20d～24d含量顯著升高，24d含量介于發酵4d～8d之間，24d～28d含量顯著降低，28d～32d未檢測出。Rb3在發酵0d～2d含量升高，1d～2d含量接近，2d～24d含量逐漸降低，24d～32d未檢測出。整個發酵過程中2種皂苷含量的變化過程不相同，Rb2含量有2次升高過程，Rb3有1次升高過程；Rb2完全轉化需28d，Rb3完全轉化需24d。赤芝固體發酵不同時期可以獲得皂苷含量不同的發酵基質(圖2)。

2.3 菌絲生長與皂苷含量分析

結合圖1和圖2進行分析，在接種后0d～6d，2種皂苷含量出現先升高后降低的變化，說明從液體菌種到固體發酵培養菌絲過程中，在菌體酶系作用下，Rb2和Rb3含量變化顯著；6d～20d菌絲逐漸長滿基質，2種皂苷含量均逐漸減低，說明伴隨菌絲長滿基質皂苷含量降低。菌絲長滿基質后，Rb3含量繼續減少直到基質中檢測不到；Rb2含量出現先升高后降低為0的過程，說明發酵后期隨著菌體對基質的持續利用，不同皂苷含量變化相差較大。

3 討論

利用真菌發酵對人參皂苷進行轉化具有積極意義。劉洋選用黑根霉對紅參水煎液進行液態發酵研究證實，發酵產物增強記憶活性顯著高于紅參水煎液。發酵產物的高效液相色譜檢測證實，人參皂苷組分發生變化，稀有皂苷Rg3、Rg5等增加；王洪峰報道，人參固態發酵30d后總皂苷含量減少，但稀有皂苷Rg3、Rh1含量增加。本試驗對赤芝、人參雙向固態發酵進行了研究，證實赤芝固態發酵對人參皂苷Rb2和Rb3有轉化作用，并且伴隨發酵的進行，能夠降低其在基質中的含量。

[1]莊毅.中藥內的生物制藥——固體發酵工程系列及其真菌藥物[J].菌物研究,2013,11(2):63-71.

[2]劉玉蓮.人參皂苷Rb組單體和Rd對心肌缺血干預作用及機制的研究[D].長春:吉林大學,2009.

[3]王友聯,劉一鳴,孫偉倫,等.人參皂苷Rb3及Rb2組合物對大鼠實驗性心肌梗死的保護作用[J].人參研究,2012,(2):2-5.

[4]孟凡麗,蘇曉田,鄭毅男.人參皂苷Rb3對糖尿病模型小鼠的降血糖和抗氧化作用[J].南京農業大學學報,2013,34(4):553-557.

[5]鄒吉野,李瑩,王德馨,等.六神曲的發酵菌種分離及純種發酵考察[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(16):12-14.

[6]王世宇,任振麗,傅超美,等.半夏曲發酵處方的篩選[J].華西藥學雜志,2009,24(4):367-369.

[7]劉洋.紅參水煎液的液體發酵工藝優化及產物藥理活性研究[D].長春:吉林農業大學,2012.

[8]王洪峰,邱智東,朱凱.人參雙向固體發酵過程中化學成分的變化[J].吉林農業大學學報,2013,35(3):316-321.

[9]蘇建樹.雙向固態發酵附桂骨痛復方化學成分的研究及HPLC指紋圖譜的建立[D].北京:北京化工大學,2010.