活血壯筋膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

楊玉霞，劉競(jìng)研，于秀華，孫丹丹，陳凡波，尹建元，趙蕓浩，孟勤

(1．吉林大學(xué)藥學(xué)院 a．天然藥物化學(xué)教研室； b．藥學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，長(zhǎng)春 130021； 2．東北師范大學(xué)附屬中學(xué)，長(zhǎng)春 130021)

活血壯筋膠囊由紅花、血竭、桂枝、人參等11味中藥組成，具有祛風(fēng)活血、強(qiáng)腰壯筋的功效，臨床用于筋骨疼痛、周身麻木、半身不遂、口歪眼斜[1]。活血壯筋膠囊是在不改變?cè)瓉?lái)劑型制備工藝前提下，由活血壯筋丸改為膠囊劑[2]。為了進(jìn)一步提高制劑質(zhì)量控制水平，本試驗(yàn)增加了人參、桂枝、紅花的薄層色譜鑒別方法，采用高效液相色譜法建立了血竭中血竭素高氯酸鹽的含量測(cè)定方法。為活血壯筋膠囊的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，使制劑質(zhì)量得到更好控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10ATvp型高效液相色譜儀(日本島津公司)，SPD-10Avp紫外檢測(cè)器、CAMAG型薄層色譜掃描儀(瑞士CAMAG公司)；薄層板(青島海洋化工廠分廠)； BT125D電子天平(0.01mg，德國(guó)賽得利斯有限公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

活血壯筋膠囊(批號(hào)120101-120303，西安瀾泰藥業(yè)有限公司)；人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào)0703-200221)、人參皂苷Re對(duì)照品(批號(hào)110754-200218)、人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào)0703-200221)、人參對(duì)照藥材(批號(hào)120917-200609)、桂皮醛對(duì)照品(批號(hào)110710-201217)、紅花對(duì)照藥材(批號(hào)120907-201609)、血竭素高氯酸鹽對(duì)照品(批號(hào)0811-200203，中國(guó)北京藥品生物制品檢定院)；乙腈為色譜純；水為重蒸餾水；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1人參的薄層鑒別取本品內(nèi)容物4g，置具塞錐形瓶中，加甲醇30mL，超聲處理30min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用乙醚振搖提取3次，每次20mL，棄去，水層用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20mL，合并提取液，用正丁醇飽和的氨試液洗滌2次，每次30mL，棄去，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次20mL，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液[3]。另取人參藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取人參皂苷Rb1、人參皂苷Re及人參皂苷Rg1對(duì)照品，加甲醇制成每1mL各含2mg的混合溶液作為對(duì)照品溶液。另按處方比例及工藝制法制備缺人參的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取對(duì)照藥材溶液與對(duì)照品溶液各4μL，供試品溶液與陰性對(duì)照溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光及紫外光燈(365nm)下檢視[4]。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的3個(gè)紫紅色斑點(diǎn)，紫外光燈(365nm)下，顯相同1個(gè)黃色和2個(gè)橙色熒光斑點(diǎn)。陰性樣品在此對(duì)應(yīng)位置上無(wú)斑點(diǎn)，即陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

2.1.2桂枝的薄層鑒別取本品內(nèi)容物4g，置500mL圓底燒瓶中，加水200mL，按《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄揮發(fā)油測(cè)定法，連接揮發(fā)油提取器，自提取器上端加水使充滿刻度部分，再加入乙酸乙酯2mL，連接回流冷凝管，加熱回流2h，分取乙酸乙酯層，用少量乙酸乙酯沖洗刻度部分，洗液并入乙酸乙酯液中，蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液。另取桂皮醛對(duì)照品，加乙醇制成每1mL含1μL的溶液，作為對(duì)照品溶液。另按處方比例及工藝制法制備缺桂枝的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液2μL，供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30℃～60℃)-乙酸乙酯(17∶3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2，4-二硝基苯肼乙醇試液[5]。供試品色譜中，在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品在此對(duì)應(yīng)位置上無(wú)斑點(diǎn)，即陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

2.1.3紅花的薄層鑒別取本品內(nèi)容物4g，置錐形瓶中，加80%丙酮20mL，振搖15min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5mL使溶解，用乙醚提取3次，每次20mL，棄去，水層揮盡乙醚后上已處理好的D101大孔樹(shù)脂柱(內(nèi)徑1.5cm，柱高10cm)，用60mL水洗脫，棄去，再用30%乙醇1000mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0%乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液。另取紅花對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液。另按處方比例及工藝制法制備缺紅花的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液與陰性對(duì)照溶液各5μL，對(duì)照品溶液2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶4)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干[6]。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點(diǎn)。陰性樣品在此對(duì)應(yīng)位置上無(wú)斑點(diǎn)，即陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

2.2 血竭含量測(cè)定

2.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：Shim-Pack VP-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液(43∶57)，流速1.0mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)440nm。理論板數(shù)按血竭素高氯酸鹽峰計(jì)算應(yīng)不低于3500。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取血竭素高氯酸鹽10mg，置25mL棕色量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL，置10mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得每1mL含血竭素29μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液(血竭素重量=血竭素高氯酸鹽重量/1.377)。

2.2.3供試品溶液的制備取本品內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約0.8g精密稱定，置25mL棕色量瓶中，加入3%磷酸甲醇溶液20mL，超聲處理30min，放至室溫，加3%磷酸甲醇溶液至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液5mL，置10mL棕色量瓶中，加3%磷酸甲醇至刻度，搖勻，即得[7]。

2.2.4空白試驗(yàn)按供試品溶液制備時(shí)取樣量，折算成處方中除血竭外其他藥材的取樣量，按活血壯筋膠囊制法制成樣品，再按供試品溶液制備方法制成空白溶液。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液各10μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。對(duì)照品、供試品在相同的保留時(shí)間內(nèi)有吸收峰，而空白對(duì)照溶液在此相應(yīng)保留時(shí)間無(wú)吸收峰，說(shuō)明陰性無(wú)干擾(圖4、圖5、圖6)。

2.2.5線性關(guān)系的考察分別精密吸取對(duì)照品溶液4.0μL、8.0μL、10.0μL、12.0μL、16.0μL、20.0μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。回歸方程為Y=1 612 285.836X-4855.209 5，r=0.999 9。線性范圍：0.080 64μg～0.403 2μg。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)依上述色譜條件，分別在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h測(cè)定同一批(批號(hào)：120105)供試品溶液，吸收峰峰面積RSD為0.67%。表明供試品溶液中血竭素高氯酸鹽在24h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.2.7中間精密度試驗(yàn)按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備的對(duì)照品溶液重復(fù)測(cè)定6次，吸收峰峰面積基本不變，RSD為0.28%(n=6)，表明中間精密度良好。

2.2.8重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一批號(hào)(批號(hào)：120105)樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，依法進(jìn)行測(cè)定，RSD為1.08%。

2.2.9加樣回收率試驗(yàn)精密取已知含量的同一批號(hào)樣品(批號(hào)：120105)6份，研細(xì)，取約0.5g(含量為0.525 4mg/g)，精密稱定，精密加入對(duì)照品溶液2mL(濃度為0.126mg/mL)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。試驗(yàn)結(jié)果表明，回收率平均值為97.89%，RSD值為1.40%，證明此方法可行。

表1回收率試驗(yàn)結(jié)果

Table1Thesamplerecoveryoftheprocedure

序號(hào)Number取樣量(g)SampleMeasurement樣品含量(μg)Samplecontrnt加入量(μg)Additionamount測(cè)得量(μg)Measuredcontent回收率(%)Recoveryrate平均值(%)AveragevalueRSD(%)1047020049400504009896412050950053500504010289774304779005020050400996979840501600527005040103210018505073005330050401029984060471100495005040098296629789140

2.2.10樣品含量測(cè)定按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10μL，分別進(jìn)樣，測(cè)定。見(jiàn)表2。

表2樣品含量測(cè)定結(jié)果

Table2ThecontentsofdracohodinperochlorateinHuoxuezhuangjincapsules

批號(hào) Bathnumber120101120102120103120104120105120201120202120301120302120303含量(mg)Content對(duì)照品reference01077010240107900992010300098801072011520111801001樣品sample01088010510106100971010230097801067011770108400977

根據(jù)10批樣品測(cè)定的結(jié)果，另外考慮到藥材產(chǎn)地、儲(chǔ)藏及生產(chǎn)的波動(dòng)。另因血竭中血竭素不十分穩(wěn)定，怕光、怕熱，所以按每粒平均含量0.105 3mg的80%計(jì)算，規(guī)定每粒含血竭以血竭素計(jì)不得少于0.085mg。

3 討論

本研究采用薄層色譜法對(duì)處方中人參、桂枝和紅花3味藥進(jìn)行了定性鑒別，因其處方成分復(fù)雜，為了排除干擾，在人參及紅花的檢測(cè)項(xiàng)中，將前處理步驟進(jìn)行了優(yōu)化，而桂枝的主要成分桂皮醛為揮發(fā)性成分[7]，采用揮發(fā)油提取法，方法簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)。結(jié)果薄層斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好，陰性無(wú)干擾，可以列入活血壯筋膠囊的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

血竭素為色原酮類(lèi)化合物，見(jiàn)光易分解，性質(zhì)不穩(wěn)定，因此本試驗(yàn)的對(duì)照品和樣品為避免強(qiáng)光照射均儲(chǔ)存于棕色瓶中。以3%磷酸甲醇溶液作為溶劑，可使樣品中的血竭素轉(zhuǎn)變?yōu)檠咚亓姿猁}，增強(qiáng)穩(wěn)定性[8]。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法建立了血竭素含量測(cè)定方法，該方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，重復(fù)性及回收率良好，可以列入活血壯筋膠囊的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，亦可為中藥復(fù)方中血竭素測(cè)定提供參考。

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