水貂腸炎病毒NS1基因進(jìn)化分析

張海玲，張蕾，胡博，白雪，趙建軍，劉昊，徐淑娟，苗立光，馮卓，閆喜軍

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112)

水貂腸炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)是貓泛白細(xì)胞癥病毒(FPV)的變異體，可在腸系膜淋巴結(jié)和隱窩上皮細(xì)胞內(nèi)高度復(fù)制，是以腸黏膜脫落和腹瀉為特征的急性、烈性、高度接觸性傳染病的病原體[1，2]。在自然條件下，不同品種和不同年齡的水貂均有感染性，但幼貂感染性極強(qiáng)。MEV引起的水貂病毒性腸炎最早于1949年由Schofield報(bào)道，1952年由Wills分離、鑒定并命名為水貂腸炎病毒[3，4]。在我國(guó)，最早于1981年，由姜廷秀報(bào)道。目前，該病蔓延全國(guó)。隨著特種養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病毒性腸炎已經(jīng)成為危害水貂養(yǎng)殖的三大疫病之一，給養(yǎng)貂業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5，6]。

水貂腸炎病毒為單鏈線(xiàn)性DNA病毒，長(zhǎng)約5000bp[7，8]，主要編碼VP1、VP2、NS1、NS2 4種蛋白。其中，VP1、VP2為結(jié)構(gòu)蛋白；NS1、NS2為非結(jié)構(gòu)蛋白。NS1蛋白對(duì)MEV的復(fù)制具有重要調(diào)節(jié)作用。有報(bào)道稱(chēng)，NS1蛋白個(gè)別氨基酸的改變可能會(huì)影響到細(xì)小病毒的細(xì)胞嗜性。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)對(duì)MEV NS1基因的檢測(cè)報(bào)導(dǎo)。本研究通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)4個(gè)地區(qū)的樣品中MEV NS1基因的克隆測(cè)序，初步了解MEV NS1基因的變異特性，為以后對(duì)MEV NS1基因的研究及MEV的感染控制提供流行病學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

將遼寧省、吉林省、山東省、河北省采集的發(fā)病致死水貂腸道組織低溫冷凍處理后送至實(shí)驗(yàn)室，無(wú)菌加入10倍PBS，研磨，離心取上清液，冷藏待檢。樣品編號(hào)及詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表111份水貂腸炎病毒陽(yáng)性樣品采集信息

Table1Informationsof11positivesamplescollectedfromminkenteritisvirus

樣品編號(hào)SampleNO．省份Province年份YearsLN(08)1遼寧Liaoning2008LN(08)2遼寧Liaoning2008LN(08)3遼寧Liaoning2008JL(09)1吉林Jilin2009JL(09)2吉林Jilin2009JL(09)3吉林Jilin2009LN(09)1遼寧Liaoning2009LN(09)2遼寧Liaoning2009HB(09)1河北Hebei2009SD(09)1山東Shan?dong2009SD(10)1山東Shan?dong2010

1.2 質(zhì)粒與菌種

大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞和pMD18-TVector(大連寶生物工程有限公司)。

1.3 主要試劑

MiniBEST Viral DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑、Marker DL2000(TaKaRa公司)；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(Bioer公司)。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank MEV-B株序列(FJ592174)設(shè)計(jì)上、下游引物NS-1/NS-2、NS-3/NS-4，分2段測(cè)序，引物序列見(jiàn)表2。

表2水貂腸炎病毒NS1基因序列擴(kuò)增引物

Table2AmplificationprimersofMinkenteritisparvovirusNS1gene

引物編號(hào)PrimerNo序列(5′-3′)Sequences退火溫度(℃)ReturntemperatureNS-1CCATAGACCGTTACTGACATTCG53NS-2TACAGCTTGTGCTATGGCTTGAGNS-3AAATGATGGCACAACCAGGAGG56NS-4ACCTGGAGGCACAAGTCCTATAA

1.5 核酸的提取及PCR擴(kuò)增

按照試劑盒提供的操作手冊(cè)從組織樣品研磨上清液中提取DNA。用PCR擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)體系：10×LATaqbuffer 5μL、dNTP(2.5mmol/L)4μL、引物NS-1/NS-2和NS-3/NS-4(50pmol/L)各1μL、模板DNA 1μL、LATaq酶0.25μL，加去離子水至50μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 45min，54℃ 1min ，72℃ 2min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.6 重組質(zhì)粒的克隆與鑒定

取4.5μL純化產(chǎn)物與0.5μL pMD18-T載體(50ng/μL)進(jìn)行連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Ampicillin抗性平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，對(duì)單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定。陽(yáng)性菌落接種5mL含Ampicillin的LB營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)增殖，提取質(zhì)粒。用BamHI和HandIII 雙酶切鑒定后，送TaRaKa公司測(cè)序。

1.7 序列比對(duì)、同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)得的上、下2段序列用DNAstar分子生物學(xué)軟件進(jìn)行拼接，并用DNAstar與GenBank公布的其他細(xì)小病毒序列進(jìn)行比對(duì)同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析，引用序列見(jiàn)表3。

表3引用參考序列

Table3Referencesequencecitedinthisstudy

編號(hào)NO毒株StrainsGenBank登錄號(hào)GenBankAccessionNo基因型Genotype國(guó)家Country1CPV-bM38245CPV-2USA2CPV-13EU659118CPV-2aUSA3Cpv-2aAJ564427CPV-2aIndia4Fpv-CU-4M38246FPVUSB5MEVBFJ592174MEVChina6cpv-15AY787926CPVUSA7fpv-TU4AB000067FPVJapan8fpv-TU8AB000069FPVJapan9MEVAbashiriD00765MEVJapan10CAENFRA3009FN6695071FPVGermany

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)及NS1基因序列分析

在送檢的32份樣品中檢測(cè)出21份陽(yáng)性樣品，在檢測(cè)的幾個(gè)地區(qū)中均有陽(yáng)性樣品分布。每個(gè)地區(qū)選取1～3份時(shí)間、地點(diǎn)、臨床癥狀有差異的樣品共計(jì)11份進(jìn)行NS1基因的克隆和測(cè)序，結(jié)果顯示，NS1基因全長(zhǎng)2007bp，編碼668個(gè)氨基酸。核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別為98.8%～100.0%和98.5%～100%；本次測(cè)序序列和國(guó)內(nèi)毒株MEVB基因的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列同源性為98.7%～99.9%和98.7%～99.9%；與國(guó)外毒株MEVAbashiri基因的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列同源性為99.0%～99.5%和98.7%～99.1%。通過(guò)對(duì)11株肉食獸細(xì)小病毒株和已知的9株參考毒株NS1基因氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有34個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在變異，見(jiàn)表4。

表4NS1基因變異氨基酸位點(diǎn)

Table4AminoacidvariationsitesofNS1genes.

病毒株StrainsMEVNS1氨基酸變異位點(diǎn)VariationsitesofMEVNS1aminoacid10233340438892128194222227247248249282286350進(jìn)化分支EvolutionarybranchJL(09)1V----------QI----1JL(09)2V----------QI----1LN(08)1V----------QI----1LN(08)2V--R-R----DQI----1HB(09)1V----------QI----1LN(08)3V-------R--QI----1SD(09)1--G---L--I-------2SD(10)1-----------------2JL(09)3-----------------2LN(09)2-------R---------2LN(09)1V----------QI----3Cpv-13V----------QI----3Cpv-15V----------QI----3Cpv-bV----------QI----3Cpv-2aV----------QIGGQ-3MEVAbashiriV---H-----------N4

續(xù)表4

病毒株StrainsMEVNS1氨基酸變異位點(diǎn)VariationsitesofMEVNS1aminoacid10233340438892128194222227247248249282286350進(jìn)化分支EvolutionarybranchFpv-CU-4VD---------------5Fpv-TU4V----------------5Fpv-TU8V----------------5病毒株StrainsMEVNS1氨基酸變異位點(diǎn)VariationsitesofMEVNS1aminoacid436443528540543544545572574576585595610616622629662進(jìn)化分支EvolutionarybranchJL(09)1--NA--E-I----D-Q-1JL(09)2---A--E-I----D-Q-1LN(08)1---A--E-I----D-Q-1LN(08)2---A--E-I----D-Q-1HB(09)1---A--E-I----D-QG1LN(08)3---A--E-I----D-Q-1SD(09)1---A--E-I----DAQ-2SD(10)1---AS-E-IL---D-Q-2JL(09)3---A--E-I---GD-Q-2LN(09)2---A--E-I----D-Q-2LN(09)1-----FE-I--Q-D-Q-3Cpv-13------E-I--Q-D-Q-3Cpv-15------E-I--Q-D-Q-3Cpv-b------E-I--Q-D-Q-3Cpv-2aP----FE-I--Q-D-Q-3MEVAbashiri------E------D-Q-4Fpv-CU-4-V------I----D-Q-5Fpv-TU4-------K--E--D-Q-5Fpv-TU8--------I----D-Q-5

注：MEVB毒株(GenBank登錄號(hào)：FJ592174)NS1基因氨基酸序列作為參考序列；“-”.與參考序列相同的氨基酸位點(diǎn)。

Note:Amino acid sequence of the strain MEVB NS1 gene(GenBank accession number:FJ592174)as the reference sequence;“-”.represents the same amino acid position with reference sequence.

2.2 NS1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

本次檢測(cè)的11個(gè)樣本主要分為3個(gè)分支，其中DL1與CPV-2a在同一分支(圖1)。

3 討論

水貂細(xì)小病毒、犬細(xì)小病毒(CPV)和貓細(xì)小病毒進(jìn)化關(guān)系密切，其中，水貂細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒都是FPV的突變體[9]。三者在感染時(shí)都利用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體[10]，但是，只有CPV能夠感染貓腎和犬腎細(xì)胞，而且FPV和CPV二者宿主范圍的不同主要是由于衣殼蛋白VP2的變異及VP2和犬或貓轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的相互作用[11，12]。

NS1蛋白對(duì)細(xì)小病毒復(fù)制具有重要的調(diào)節(jié)作用，MEV的NS1基因含有1個(gè)ORF，全長(zhǎng)2 007bp，共編碼668個(gè)氨基酸。在細(xì)小病毒NS1蛋白中含有1個(gè)長(zhǎng)約150個(gè)氨基酸的保守區(qū)域，這段保守區(qū)域從389位氨基酸開(kāi)始，并含有391GKRN394保守序列，在不同細(xì)小病毒中，這一區(qū)域的氨基酸相似性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他區(qū)域。在這段區(qū)域中含有與ATPase或GTPase相關(guān)的ATP或GTP結(jié)合位點(diǎn)，并具有解旋活性，是病毒DNA復(fù)制所必需的。本實(shí)驗(yàn)中所有測(cè)序序列均含有391GKRN394保守序列，但JL(09)1株在保守區(qū)域內(nèi)發(fā)生了改變，在528位的D(Asp)到N(Asn)的突變，該處改變是否對(duì)NS1的抗原性產(chǎn)生影響，有待于進(jìn)一步的研究。

MEV最早報(bào)道于1949年，CPV最早報(bào)道于1978年，雖然報(bào)道的時(shí)間相差很大，但現(xiàn)在還不能說(shuō)明他們之間的關(guān)系及進(jìn)化順序。關(guān)于細(xì)小病毒的進(jìn)化推測(cè)最多的就是MEV和CPV由FPLV進(jìn)化而來(lái)。但CPV與MEV之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本試驗(yàn)中檢測(cè)的序列獨(dú)自分為2支。其中DL1與CPV在同一進(jìn)化分支，其與CPV的氨基酸同源性高達(dá)99.7%，氨基酸位點(diǎn)相對(duì)于CPV未發(fā)生特異的改變，其是否顯示了MEV與CPV的NS1基因發(fā)生重組，還有待進(jìn)一步證實(shí)。

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