KRAS基因在胰腺癌發生發展中的作用

莢敏，黃培林

(東南大學醫學院，江蘇 南京 210009)

胰腺癌是臨床上常見的且死亡率極高的一種消化系統惡性腫瘤。早在2008年估計全球范圍內胰腺癌發病即為27.7萬例，死亡26.6萬例[1]。2007年，中國腫瘤登記地區腫瘤發病與死亡分析報告顯示：胰腺癌發病位于第7位，死亡率位居第6位[2]。尋求合適的預測診斷分子、研究有效的治療手段一直是目前國內外專家的工作重點。

早在1988年，人們就發現了原癌基因KRAS和胰腺癌之間的關系[3]，后續的大量研究結果顯示，大多胰腺腫瘤中都存在KRAS基因突變。然而，不論是將KRAS分子作為胰腺癌的特異性生物標志物的研究，還是嘗試通過抑制KRAS分子的活性來治療腫瘤的研究都均以失敗告終。近年來，隨著一些新技術的出現，新的研究結果提示，過去我們對KRAS及胰腺癌的很多認識是不準確的。那么KRAS與胰腺癌的關系究竟如何？作者就KRAS基因在胰腺癌發生發展中作用的相關研究進展作一綜述。

1 KRAS基因及其突變

1.1 KRAS基因

KRAS基因屬于RAS基因家族中一員，含有4個編碼外顯子和1個5′端非編碼外顯子，共同編碼含189個氨基酸的膜結合型KRAS蛋白[4]。KRAS蛋白通過與GTP/GDP結合來調節細胞生長、分化，形成細胞內一種調節“開關”。當KRAS蛋白與GDP結合時，“開關”關閉，不能激活下游的信號通路。而在鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)的作用下，GTP與GDP發生交換，形成KRAS- GTP復合物，此時則可以激活下游信號通路，使“開關”處于開放狀態。部分KRAS下游信號分子同時還可以促進GEFs的轉化作用，促進KRAS活化，形成一種正循環。然而KRAS并不總處于開放狀態，KRAS本身具備一定的自限性GTP水解活性，此外，細胞內存在一種GTP酶激活蛋白(GTPase- activating proteins，GAPs)可以激活GTP酶水解GTP為GDP，使“開關”重新關閉，從而使KRAS活化處于一種動態平衡中[5]。

1.2 KRAS 基因突變

在正常細胞內，KRAS通過與GTP或GDP與循環結合使細胞的生長、分化處于平衡穩態中。但當KRAS基因發生突變時，特別是KRAS與GAPs蛋白結合位點發生改變時[6]，GTP水解障礙，KRAS蛋白則一直處于活化狀態，影響信號轉導途徑，使信號傳遞通路處于持續激活狀態，從而導致細胞向惡性轉化成為癌細胞[5]。

KRAS基因突變一般發生在腫瘤惡變的早期[7]，KRAS基因常見的突變位點多在2號外顯子的第12、13密碼子，且多以點突變形式出現。其常見的3種突變類型是GGT>GAT(G12D)、GGT>GTT(G12V)、GGC>GAC9 G13D)[8]。

2 KRAS突變與胰腺癌關系

研究顯示，幾乎所有的胰腺腫瘤中都存在KRAS突變[9- 10]。然而KRAS與胰腺癌的關系是復雜的：一方面并非所有KRAS分子均會與GTP結合，即使與GTP結合也不一定能產生KRAS激活的下游效應，其他的因素，例如細胞內部的布局可能會影響KRAS- GTP與下游效應分子的結合[11]；另一方面，即使KRAS與GTP結合并激活了下游信號通路也不一定能夠使胰腺細胞發生癌變。很多研究發現，在健康人的不同器官里，如胰腺、結腸、肺等都可能存在突變狀態的KRAS分子[12]。有人認為，啟動腫瘤的發生需要KRAS活躍達到一定程度，來保證其能激活下游信號通路[9]。因此，即使KRAS已經發生了突變，還需要有其他因素(內源性或外源性的)來促進腫瘤的發生。

3 KRAS在胰腺癌發生中的作用

KRAS突變不僅在腫瘤中存在，隨著年齡的增長，肺、胰腺、結腸以及其他正常組織中也會發生KRAS突變。既然KRAS突變如此常見，為什么只有小部分人會患病呢？一種最新的觀點認為，原癌基因KRAS并不總處于激活狀態[13]。換句話說，僅僅有KRAS基因還不足以使細胞癌變，還可能需要其他的內在或外在的環境因素來增加KRAS活動閾值，去除腫瘤形成過程中的障礙。

有人認為，上皮生長因子、炎癥刺激等可以刺激KRAS激活，在KRAS誘導的胰腺癌中扮演重要角色[14]。而非甾體類抗炎藥或各類抗氧化藥物不僅可以降低腫瘤發生風險，也能夠抑制KRAS的活性。除此之外，人們還發現細胞本身對高水平KRAS活動具有一定的耐受性。KRAS的高表達壓力可能直接導致細胞衰老或凋亡[15]。那些能夠抑制細胞凋亡的因素，如抑癌基因如p16或p53[16]的丟失則可能阻止KRAS高表達壓力所帶來的細胞凋亡，從而最終引起腫瘤的發生。不過有一些反對派也堅持認為，KRAS本身就能抑制細胞衰老，抑制p16的表達[17]。然而不管怎樣，如果沒有KRAS突變，不論是炎癥狀態還是抑癌基因丟失本身都不足以直接啟動胰腺癌的發生[18]。由此可見，KRAS在胰腺癌的發生中至關重要。

4 KRAS在胰腺癌進展中的作用

雖然大量的證據顯示KRAS在胰腺癌的形成中非常重要，但過去人們對KRAS在胰腺癌發展維持中的作用了解相對較少。近年來，隨著胰腺癌基因工程鼠模型的創建，人們對KRAS在胰腺癌形成中的作用有了進一步的認識。

4.1 胰腺癌形成的早期

胰腺癌細胞的基因組高度不穩定，每個腫瘤的形成都是積累了數百種突變的結果[12]。從一個正常的胰腺細胞發展成突變的細胞需要很多步，每一步都需要基因表達的改變。顯然，胰腺癌從形成到突變并不是都相同的。早期的人類胰腺上皮內瘤變內存在KRAS突變，通常不伴有其他基因改變[19]，然而，腫瘤的進展則需要在抑癌基因例如p16失活的情況下才能發生。在人體，散在的KRAS突變是可能發生的，大多情況下這些細胞會以凋亡的形式被清除掉，而那些獲得其他突變從而逃逸凋亡的細胞則發生癌變。

近年來，研究者們創建了一種可以逆轉胰腺KRAS表達的老鼠模型，稱為KRAS*或iKRAS鼠[20-21]。與常規表達內源性KRAS蛋白的KC鼠不同，iKRAS鼠并不是從內源性KRAS位點表達KRAS，但其表達水平卻與內源性相當。予以iKRAS鼠應用蛙皮素(caerulein)可以引起急性胰腺炎，從而形成胰腺上皮內瘤變。胰腺內廣泛的炎癥可導致胰腺腺管損傷，使腺管向導管的轉化。在正常情況下，胰腺組織修復隨后迅速進行，胰腺將在1周內恢復到正常組織形態。然而iKRAS鼠的胰腺組織在應用蛙皮素后并不能迅速修復[20，22]，腺管向導管轉變形成發育不良的導管結構，周圍廣泛纖維化，3周內幾乎所有的導管結構呈現出胰腺上皮內瘤變的組織結構。

研究發現，iKRAS鼠需要額外的突變才能從早期的損傷進展為腺癌，這也與人類胰腺癌的發展過程類似[23]。在人類胰腺腫瘤中通常可以檢測到多重抑癌基因的丟失、失活或者突變。在老鼠中，存在抑癌基因以不同概率散在的丟失，其比率依賴于炎癥的程度以及KRAS的活動水平。例如，在表達內源性KRAS的KC鼠，抑癌基因P53在腫瘤發展的最后階段突變或者丟失。在表達高水平KRAS的人造LGL鼠模型中，p16迅速發生丟失[24]。其可能機制為，高水平的KRAS為胰腺癌細胞丟失p16提供一種選擇壓力，從而逃逸KRAS介導的細胞凋亡[15]。

為了探究KRAS信號在這些改變中的作用，人們研究了在不同階段KRAS表達失活所帶來的不同影響。在胰腺上皮內瘤變的早期，KRAS失活使發育不良的導管表達腺管基因而使導管基因失活，調節上皮細胞重新分化。如果在胰腺上皮內瘤變晚期KRAS失活，細胞則會發生凋亡。研究發現，攜帶有p53失活的iKRAS鼠能夠迅速形成胰腺癌，并且伴有高度穿透能力，因此被用來研究侵襲瘤中KRAS失活帶來的影響。結果顯示，此時KRAS失活則引起腫瘤細胞增殖、生存能力丟失，從而引發腫瘤迅速退化[20- 21]。然而，并不是所有的腫瘤細胞在KRAS失活時都立即死亡，事實上有一部分的腫瘤細胞保持著一種休眠狀態[25]，一旦KRAS復活則迅速恢復生長，這些休眠細胞則有可能發展成為癌干細胞。這一結果表明，KRAS不僅在腫瘤形成中重要，在腫瘤的發展過程中也同樣重要。

4.2 胰腺癌進展

胰腺癌的微環境中包含了廣泛存在的炎癥介質，KRAS在腫瘤的免疫炎癥微環境中同樣發揮著作用。在胰腺上皮內瘤變形成的最早期，損傷誘導間葉來源的細胞形成成纖維細胞和胰島星狀細胞。胰腺上皮內瘤變的形成和進展階段則伴隨著免疫細胞的浸潤[26]，而KRAS的失活則可以解除與胰腺癌相關的慢性炎癥狀態。

KRAS可以調節維持微環境介質的各種因子，如白細胞介素-6(interleukin- 6，IL- 6)、前列腺素E[27]，這些因子都以一種KRAS依賴的形式表達[20]。炎癥細胞因子IL-6在胰腺腫瘤中的過表達對于老鼠胰腺上皮內瘤變發展很重要[28]。前列腺素E通過前列腺素受體4直接作用于星狀細胞，促進基質生成[27]。

同樣，浸潤在胰腺癌中的免疫細胞似乎也受KRAS的調節。在鼠胰腺癌模型中，胰腺上皮內瘤變組織中浸潤有多種免疫細胞，包括抑制免疫反應的調節性T細胞、骨髓來源的抑制性細胞[26]。表達KRAS的腫瘤通過旁分泌方式分泌細胞因子，如粒細胞集落刺激因子[29]，募集骨髓來源的抑制細胞，從而抑制抗腫瘤的免疫反應。KRAS失活導致所有的浸潤免疫細胞數量下降。因此，胰腺癌內的炎癥微環境似乎在以一種胰腺自己的方式受KRAS調節，形成一種KRAS-炎癥正反饋機制。然而還有哪些細胞、哪些因子參與其中，其作用機制如何目前并不清楚。

4.3 胰腺癌進展

與其他實體瘤不同，胰腺癌內存在大量結締組織而缺乏血管，形成一種乏氧微環境[30]。而胰腺癌細胞似乎可以通過多種機制來適應這種低氧環境。例如通過改變糖酵解途徑降低其對Krebs循環的依賴來提高糖代謝[31]。最近也有研究顯示，胰腺癌細胞也可以通過控制代謝相關基因轉錄的調節因子來適應其代謝變化[26]。因此，那些能夠通過作用于KRAS或其效應分子，從而改變腫瘤細胞代謝或是損傷腫瘤細胞維持高水平糖酵解能力的藥物，則有望用于治療胰腺癌[32]。

5 結 語

目前的研究結果表明，持續穩定高水平KRAS活性對于胰腺癌的形成是必須的。雖然其中很多具體機制目前仍不十分清楚，但是，KRAS與胰腺癌發生、發展的密切關系可以為臨床胰腺癌防治新途徑提供理論依據。例如KRAS受上游信號調節，可通過調整飲食或者生活方式預防炎癥反應從而降低激活KRAS的可能性。此外，KRAS失活的研究表明，KRAS激活不僅在腫瘤的形成中非常重要，在腫瘤的發展維持中同樣必不可少。因此，KRAS將可能成為將來治療胰腺癌的一個重要靶點。

[1] FERLAY J，SHIN H R，BRAY F，et al.Estinates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer，2010，127(12):2893- 2917．

[2] 陳萬青，張思維，鄭榮壽，等.中國腫瘤登記地區 2007年腫瘤發病和死亡分析[J].中國腫瘤，2011，20(3):162- 169．

[3] ALMOGUERA C，SHIBATA D，FORRESTER K，et al.Most human carcinomas of the exocrine pancreas contain mutant c- KRAS genes[J].Cell，1988，53(4):549- 554．

[4] MALUMBRES M，BARBACID M.RAS oncogenes:the first 30 years[J].Nat Rev Cancer，2003，3(6):459- 465．

[5] SPAARGAREN M，BISCHOFF J R，McCormick F.Signal transduction by Ras- like GTPases:a potential target for anticancer drugs[J].Gene Expr，1995，4(6):345- 356．

[6] SCHEFFZEK K，AHMADIAN M R，KABSCH W，et al.The Ras- RasGAP complex:structural basis for GTPase activation and its loss in oncogenic Ras mutants[J].Science，1997，277(5324):333- 338．

[7] JIMENO A，MESSERSMITH W A，HIRSCH F R，et al.KRAS mutations and sensitivity to epidermal growth factor receptor inhibitors in colorectal cancer:practical application of patient selection[J].J Clin Oncol，2009，27(7):1130- 1136．

[8] MA E S，WONG C L，LAW F B，et al.Detection of KRAS mutations in colorectal cancer by high- resolution melting analysis[J].J Clin Pathol，2009，62(10):886- 891．

[9] BIANKIN A V，WADDELL N，KASSAHN K S，et al.Pancreatic cancer genomes reveal aberrations in axon guidance pathway genes[J].Nature，2012，491(7424):399- 405．

[10] JONES S，ZHANG X，PARSONS D W，et al.Core signaling pathways in human pancreatic cancers revealed by global genomic analyses[J].Science，2008，321(5897):1801- 1806.

[11] CAMPBELL P M，SINGH A，WILLIAMS F J，et al.Genetic and pharmacologic dissection of Ras effector utilization in oncogenesis[J].Methods Enzymol，2006，407:195- 217．

[12] PARSONS B L，MENG F.KRAS mutation in the screening，prognosis and treatment of cancer[J].Biomark Med，2009，3(6):757- 769．

[13] HUANG H，DANILUK J，LIU Y，et al.Oncogenic KRAS requires activation for enhanced activity[J].Oncogene，2014，33(4):532- 536．

[14] NAVAS C，HERNANDEZ- PORRAS I，SCHUHMACHER A J，et al.EGF receptor signaling is essential for KRAS oncogene- driven pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Cancer Cell，2012，22(3):318- 330．

[15] DENICOLA G M，TUVESON D A.RAS in cellular transformation and senescence[J].Eur J Cancer，2009，45(1):211- 216．

[16] BARDEESY N，AGUIRRE A J，CHU G C，et al.Both p16(Ink4a) and the p19(Arf)- p53 pathway constrain progression of pancreatic adenocarcinoma in the mouse[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(15):5947- 5952．

[17] LEE K E，BAR- SAGI D.Oncogenic KRAS suppresses inflammationassociated senescence of pancreatic ductal cells[J].Cancer Cell，2010，18(5):448- 458．

[18] GUERRA C，SCHUHMACHER A J，CANAMERO M，et al.Chronic pancreatitis is essential for induction of pancreatic ductal adenocarcinoma by KRAS oncogenes in adult mice[J].Cancer Cell，2007，11(3):291- 302．

[19] KANDA M，MATTHAEI H，WU J，et al.Presence of somatic mutations in most early- stage pancreatic intraepithelial neoplasia[J].Gastroenterology，2012，142(4):730- 733．

[20] COLLINS M A，BEDNAR F，ZHANG Y，et al.Oncogenic KRAS is required for both the initiation and maintenance of pancreatic cancer in mice[J].J Clin Invest，2012，122(2):639- 653．

[21] YING H，KIMMELMAN A C，LYSSIOTIS C A，et al.Oncogenic KRAS maintains pancreatic tumors through regulation of anabolic glucose metabolism[J].Cell，2012，149(3):656- 670．

[22] MORRIS J P 4TH，CANO D A，SEKINE S，et al.Beta- catenin blocks KRAS- dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice[J].J Clin Invest，2010，120(2):508- 520．

[23] YACHIDA S，JONES S，BOZIC I，et al.Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer[J].Nature，2010，467(7319):1114- 1147．

[24] JI B，TSOU L，WANG H，et al.Ras activity levels control the development of pancreatic diseases[J].Gastroenterology，2009，137(3):1072- 1082．

[25] COLLINS M A，BRISSET J C，ZHANG Y，et al.Metastatic pancreatic cancer is dependent on oncogenic KRAS in mice[J].PLoS One，2012，7(12):e49707．

[26] CLARK C E，HINGORANI S R，MICK R，et al.Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion[J].Cancer Res，2007，67(19):9518- 9527．

[27] CHARO C，HWANG R F，ARUMUGAM T，et al.PGE2 activation of the EP4 receptor regulates stellate cell activity in the pancreatic stromal microenvironment[J].Pancreas，2013，42:467- 474．

[28] LESINA M，KURKOWSKI M U，LUDES K，et al.Stat3/Socs3 activation by IL- 6 trans- signaling promotes progression of pancreatic intraepithelial neoplasia and development of pancreatic cancer[J].Cancer Cell，2011，19(4):456- 469．

[29] PYLAYEVA- GUPTA Y，LEE K E，HAJDU C H，et al.Oncogenic KRAS- induced GM- CSF production promotes the development of pancreatic neoplasia[J].Cancer Cell，2012，21(6):836- 847．

[30] HIDALGO M，MAITRA A.The hedgehog pathway and pancreatic cancer[J].N Engl J Med，2009，361:2094- 2096．

[31] SEMENZA GL.HIF- 1:upstream and downstream of cancer metabolism[J].Curr Opin Genet Dev，2010，20(1):51- 60．

[32] NEESSE A，MICHL P，FRESE K K，et al.Stromal biology and therapy in pancreatic cancer[J].Gut，2011，60(6):861- 868．