3-甲基腺嘌呤對(duì)人耐藥大腸癌SW480細(xì)胞增殖及自噬活性的影響

胡萬(wàn)樂(lè)，王玲琴，陳蘇蘋(píng)，陳榮

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合肛腸外科，浙江 溫州 325027）

3-甲基腺嘌呤對(duì)人耐藥大腸癌SW480細(xì)胞增殖及自噬活性的影響

胡萬(wàn)樂(lè)，王玲琴，陳蘇蘋(píng)，陳榮

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合肛腸外科，浙江 溫州 325027）

目的：研究自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）對(duì)耐5-氟尿嘧啶（5-Fu）結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖及自噬活性的影響，探討自噬抑制劑在逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌耐藥中的作用。方法：濃度遞增篩選法誘導(dǎo)耐5-Fu（100 μg/L）的SW480細(xì)胞株，用10 μmol/L濃度的3-MA處理后，再用5-Fu（濃度200μg/L）作用24 h。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，丹酰戊二胺（MDC）染色和電鏡檢測(cè)細(xì)胞自噬活性變化。結(jié)果：3-MA對(duì)耐藥細(xì)胞自噬活性的抑制率達(dá)89.7%，增殖抑制率為9.6%，凋亡率為5.7%，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)3-MA處理后，5-Fu對(duì)耐藥SW480細(xì)胞增殖抑制率達(dá)71.6%±2.9%，凋亡率達(dá)36.6%±2.9%，而單用5-Fu細(xì)胞增殖抑制率僅為23.6%±2.9%，凋亡率僅為10.3% ±2.5%，3-MA預(yù)處理后5-Fu對(duì)耐藥細(xì)胞的增殖抑制率及凋亡率均明顯增強(qiáng)（P＜0.05），自噬泡數(shù)量顯著減少，自噬活性明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：3-MA單用時(shí)僅有較弱的抗腫瘤作用，與5-FU聯(lián)用時(shí)耐藥細(xì)胞的增殖及自噬活性被顯著抑制，增強(qiáng)了SW480耐藥細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性，提高了化療效果。

結(jié)直腸腫瘤；自噬；3-甲基腺嘌呤；氟尿嘧啶；耐藥

自噬作為廣泛存在于真核細(xì)胞中的一種生命現(xiàn)象，在許多重大疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。自噬活性對(duì)腫瘤的影響已在結(jié)腸癌[1]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[2]、肝癌[3]等多種腫瘤中得到證實(shí)。近年研究發(fā)現(xiàn)自噬與腫瘤耐藥密切相關(guān)[4-5]，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)自噬活性的增強(qiáng)參與了SW480細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶（5-Fu）耐藥的形成[6]，但抑制自噬能否逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥，目前鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，我們?cè)谇捌谡T導(dǎo)的耐5-Fu結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的基礎(chǔ)上，引入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA），探討抑制自噬活性對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞生存率的影響，為自噬抑制劑在臨床中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑人大腸癌SW480耐5-Fu細(xì)胞株為本課題組前期通過(guò)5-Fu濃度遞增法誘導(dǎo)產(chǎn)生，能耐受濃度為100 μ g/L的5-Fu，在此濃度中SW480有持續(xù)的活性并且能穩(wěn)定增殖。5-Fu購(gòu)自德國(guó)默克公司；3-MA購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；丹酰戊二胺（MDC）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京凱基生物科技公司；胎牛血清（優(yōu)級(jí)）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：細(xì)胞在含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2，飽和濕度，待細(xì)胞達(dá)到80%的生長(zhǎng)面積時(shí)，按不同處理因素分為4組：對(duì)照（TR）組：為耐藥細(xì)胞，用培養(yǎng)液作為對(duì)照藥；5-Fu單藥（TR+5-Fu）組：只加5-Fu處理，5-Fu的終濃度為200μ g/L；3-MA單藥（TR+3-MA）組：只加3-MA培養(yǎng)，3-MA濃度為10 μ mol/L；聯(lián)合用藥（TR+3-MA+5-Fu）組：用10μ mol/L濃度的3-MA處理1 h后，再加入5-Fu（終濃度為200 μ g/ L）培養(yǎng)24 h。

1.2.2 細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)：挑選處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好、存活率高（90%以上）且致密度約為70%～80%的耐藥SW480細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液，PBS洗1次，0.25%胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，每組6個(gè)復(fù)孔，按1×105個(gè)/孔接種細(xì)胞于96孔板上，培養(yǎng)24 h后，分別加入相應(yīng)的試劑（其中3-MA濃度為10 μmol/L，5-Fu終濃度為200 μ g/L），TR組加入相同體積的培養(yǎng)液。加入后37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，加藥24 h后每孔加入10 μ L CCK-8試劑，37 ℃繼續(xù)孵育培養(yǎng)3 h，酶標(biāo)儀測(cè)450 nm光吸收值（OD值）。細(xì)胞增殖率（%）=（加藥孔OD值-空白孔OD值）/（對(duì)照孔OD值-空白孔值OD值）×100%；細(xì)胞增殖抑制率（%）=1-細(xì)胞增殖率（%）。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞，經(jīng)消化后制成單細(xì)胞懸液，按5×106個(gè)/孔接種細(xì)胞于96孔板上，細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組用藥物處理后12 h，PBS洗滌2次后，離心棄去上清后，加入500μ L染色緩沖液（binding buffer），然后加入5μ L Annexin V-FITC試劑和10μ L PI，混勻，室溫下避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 細(xì)胞透射電鏡檢測(cè)：將待檢細(xì)胞用PBS洗2次，用細(xì)胞刮刀將其刮下，制成懸液放置于玻璃試管內(nèi)，離心（3 000 r/min，10 min）成團(tuán)，去上清液后加入2.5%戊二醛固定10 min左右，去上清，然后和少量抗凝血清混合均勻，離心成團(tuán)，去上清液，沿管壁輕輕滴入2.5%戊二醛，置于4 ℃下固定1 h，用帶勾的解剖鑷勾出細(xì)胞團(tuán)，切成1 mm3大小的組織塊。組織塊經(jīng)前固定、漂洗、后固定、漂洗、塊染、梯度脫水、浸透、包埋聚合等程序處理后，用Power Tome-XL型超薄切片機(jī)切片，每個(gè)樣品厚50～60 nm，然后枸櫞酸鉛染色，最后用日本日立株式會(huì)社透射電子顯微鏡 H-7500觀察拍片（鏡下見(jiàn)膜泡結(jié)構(gòu)包裹細(xì)胞內(nèi)含物的為自噬體，其中含有變性的胞質(zhì)成分及被消化降解后形成的產(chǎn)物）。

1.2.5 MDC染色鑒定SW480細(xì)胞自噬體形成：6孔板中置入預(yù)先處理過(guò)的無(wú)菌蓋玻片，將制備好的細(xì)胞懸液加入6孔板中，使得每個(gè)孔中細(xì)胞量約為1× 105/2 mL培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。6孔板中每孔加入2μ L MDC染料，用錫箔紙包好，放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min；取出6孔板，用PBS輕柔地流水沖洗3次；然后4%的多聚甲醛（PFA）2 mL室溫固定15 min；去除PFA，細(xì)胞用PBS清洗1次；用注射器針頭勾起蓋玻片，在已經(jīng)滴加甘油（配制甘油，甘油與10× PBS以 9:1的比例混合，即將PBS稀釋為1×）的載玻片上將蓋玻片沿45 ℃角緩緩放下，使細(xì)胞層置于中間，避免氣泡產(chǎn)生。最后熒光顯微鏡觀察MDC染色情況（鏡下自噬體呈明顯的胞漿點(diǎn)狀熒光分布）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS16.0軟件和Origin6.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。每次隨機(jī)試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)均用±s表示，用單因素方差分析比較不同條件下的組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13 -MA對(duì)細(xì)胞增殖的影響單獨(dú)應(yīng)用3-MA對(duì)耐藥細(xì)胞增殖活性影響較小，細(xì)胞增殖抑制率為9.6%，與TR組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明3-MA本身有較弱的細(xì)胞抑制作用。當(dāng)3-MA與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到71.6%±2.9%，較單獨(dú)應(yīng)用5-Fu（為23.6%±2.9%）顯著增高，P＜0.05（見(jiàn)圖1）。

圖1 3-MA對(duì)各組細(xì)胞增殖的影響

2.23 -MA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響單獨(dú)應(yīng)用3-MA對(duì)耐藥細(xì)胞凋亡影響較小，凋亡率為5.7%，與TR組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明3-MA本身有較弱的抗腫瘤作用。但當(dāng)3-MA與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞凋亡率達(dá)到36.6%±2.9%，較單獨(dú)應(yīng)用5-Fu（為10.3%±2.5%）顯著增高，P＜0.05（見(jiàn)圖2）。

圖2 3-MA對(duì)各組細(xì)胞凋亡的影響

2.33 -MA對(duì)自噬的影響耐藥細(xì)胞每個(gè)高倍鏡下平均15個(gè)自噬泡，TR+5-Fu組平均14個(gè)自噬泡，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.83）；TR+3-MA組每個(gè)高倍鏡下平均約1.5個(gè)，與TR+3-MA+5-Fu組的2個(gè)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.78）。但TR+3-MA組及TR+3-MA+5-Fu組與TR組及TR+5-Fu組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖3-4）。

圖3 電鏡下典型自噬體（圖中黑色箭頭所示）

圖4 MDC染色下不同組細(xì)胞自噬水平（×400）

3 討論

自噬作為耐藥細(xì)胞生存的重要機(jī)制，信號(hào)調(diào)控十分復(fù)雜，在整個(gè)過(guò)程中關(guān)鍵分子是位于啟動(dòng)階段的I I I型PI3K和Tor/mTor激酶：I I I型PI3K通過(guò)磷酸化磷脂酰肌醇來(lái)募集胞漿中含F(xiàn)YVE或PX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，用于自噬體膜的形成，3-MA通過(guò)抑制該激酶可有效抑制自噬活性[7]；mTOR通過(guò)調(diào)控核糖體蛋白質(zhì)S6（p70S6）的活性從而發(fā)揮控制細(xì)胞自噬活性的作用[8]，而雷帕霉素能通過(guò)抑制該激酶活性，達(dá)到促進(jìn)自噬的目的[9]。實(shí)驗(yàn)證明，無(wú)論是通過(guò)基因敲除、沉默還是自噬抑制劑處理，抑制細(xì)胞自噬通路都可以極大地增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物和放療射線(xiàn)的敏感性，使腫瘤細(xì)胞的死亡率增加[1，10-11]。然而抑制自噬能否逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥特性，目前研究較少。

我們?cè)谇捌谡T導(dǎo)的耐5-Fu結(jié)直腸癌細(xì)胞株基礎(chǔ)上，引入自噬抑制劑3-MA抑制耐藥細(xì)胞的自噬活性，研究自噬抑制劑對(duì)耐藥細(xì)胞化療敏感性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)为?dú)使用3-MA對(duì)耐藥細(xì)胞增殖活性影響較小，增殖抑制率為9.6%，對(duì)耐藥細(xì)胞凋亡的影響也較小，凋亡率為5.7%，而3-MA與5-Fu聯(lián)合使用時(shí)，腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率均顯著升高，分別達(dá)71.6%±2.9%和36.6%±2.9%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單用5-Fu組。以上結(jié)果提示，自噬抑制劑3-MA僅有較弱的抗腫瘤作用，僅僅抑制耐藥細(xì)胞的自噬活性達(dá)不到殺死腫瘤細(xì)胞的目的，但3-MA具有較強(qiáng)的增敏作用，能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥，與Ahn等[12]的研究結(jié)果一致。

3-MA與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，一方面當(dāng)耐藥細(xì)胞的自噬功能被抑制后，腫瘤細(xì)胞賴(lài)以生存的核苷、氨基酸和脂肪酸等大分子物質(zhì)循環(huán)利用減少，當(dāng)一些生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵分子合成受阻時(shí)耐藥細(xì)胞的生存能力顯著下降，從而走向死亡；另一方面當(dāng)PI3K/Akt通路被抑制后，磷酸化的Akt蛋白顯著下降，信號(hào)通路下游的一些關(guān)鍵蛋白如YB-1[13]表達(dá)降低，以及重要的信號(hào)通路如VEGF-C/NRP、p38、p53等受到抑制，在5-Fu的作用下促進(jìn)了細(xì)胞的死亡。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明自噬抑制劑3-MA增強(qiáng)了5-Fu的化療敏感性，抑制腫瘤細(xì)胞自噬活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，是一種潛在的化療增敏劑，也從反面證實(shí)自噬在腫瘤細(xì)胞耐藥形成過(guò)程中起保護(hù)作用。

綜上所述，自噬在結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥獲得過(guò)程中起到了保護(hù)作用，抑制自噬，可以提高耐藥腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，但自噬在腫瘤耐藥形成過(guò)程中的具體機(jī)制及自噬抑制劑在臨床上的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

[1]Shi Y, Tang B, Yu PW, et al. Autophagy protects against oxaliplatin-induced cell death via ER stress and ROS in Caco-2 cells[J]. PLoS One, 2012, 7(11): 51076.

[2]Fu J, Liu ZG, Liu XM, et al. Glioblastoma stem cells resistant to temozolomide-induced autophagy[J]. Chin Med J (Engl), 2009, 122(11): 1255-1259.

[3]Cui J, Gong Z, Shen HM. The role of autophagy in liver cancer: molecular mechanisms and potential therapeutic targets[J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1836(1): 15-26.

[4]汪鑫, 劉天助, 郭洪波, 等. 惡性膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞通過(guò)Beclin 1上調(diào)自噬抵抗替莫唑胺化療[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 12 (8): 757-762.

[5]苑博, 康勁松, 楊曉春, 等. 自噬在紫杉醇誘導(dǎo)人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞死亡中的作用[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2013, 17(1): 46-48.

[6]胡萬(wàn)樂(lè), 何占紅, 蔣芳, 等. 5-Fu誘導(dǎo)人大腸癌SW480細(xì)胞株耐藥與自噬活性的變化[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志, 2013, 19(3): 279-284.

[7]Hirosako K, Imasato H, Hirota Y,et al. 3-Methyladenine specifically inhibits retrograde transport of cation-independent mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor from the early endosome to the TGN[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 316(3): 845-852.

[8]Mizushima N, Klionsky DJ. Protein turnover via autophagy: implications for metabolism[J]. Annu Rev Nutr, 2007, 27: 19-40.

[9]Loewith R, Jacinto E, Wullschleger S, et al. Two TOR complexes, only one of which is rapamycin sensitive, have distinct roles in cell growth control[J]. Mol Cell, 2002, 10 (3): 457-468.

[10]Groves B, Abrahamsen H, Clingan H, et al. Aninhibitory role of the G-protein regulator AGS3 in mTOR-dependent macroautophagy[J]. PLoS One, 2010, 26, 5(1): e8877.

[11]Broadley K, Larsen L, Herst PM, et al. The novel phloroglucinol PMT7 kills glycolytic cancer cells by blocking autophagy and sensitizing to nutrient stress[J]. J Cell Biochem, 2011, 112(7): 1869-1879.

[12]Ahn JH, Lee M. Suppression of autophagy sensitizes multidrug resistant cells towards Src tyrosine kinase specific inhibitor PP2[J]. Cancer Lett, 2011, 310(2): 188-197.

[13]龍璐璐, 許文林, 沈慧玲, 等. YB-1抑制三氧化二砷誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞自噬機(jī)制[J]. 山東醫(yī)藥, 2012, 52(13): 4-6.

（本文編輯：丁敏嬌）

Effect of 3-methyladenine on autophagy and cell proliferation in 5-Fu-resistant colon cancer cell line SW480

HU Wanle, WANG Lingqin, CHEN Suping, CHEN Rong.Traditional Chinese with Combined Western Medicine Anorectal, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To investigate the effects of 3-methyladenine on chemotherapy sensitivity of 5-Furesistant colon cancer cell line SW480 and reversing the 5-Furesistant in colon cancer.Methods:Stepwise 5-Fu selection was used to establish the 5-Fu resistant colon cancer cells (100 μg/L). The cells were dealed with 3-methyladenine (10 μmol/L) fistly and 5-Fu (200 μg/L) for 24 hours. Cell proliferation inhibition rate was measured with CCK-8. Apoptosis rate was detected with flow cytometer. Autophagic vacuoles in cells were observed by means of transmission electron microscopy and monodansylcadaverine (MDC).Results:The inhibition rate of 3-methyladenine in the 5-Fu resistant cell autophagy activity was 89.7%, cell proliferation was 9.6%, but apoptosis rate was just 5.7%, were obviously higher than that in 5-Fu resistant cells (P<0.05). After dealing with 3-methyladenine(10 μmol/L) fistly and 5-Fu (200 μg/L) for 24 hours, the level of cell proliferation inhibition rate was 71.6%±2.9% and the apoptosis rate was 36.6%±2.9%, while dealing with 5-Fu (200 μg/L) for 24 hours, the level of cell proliferation inhibition rate was 23.6%±2.9% and the apoptosis rate was 10.3%±2.5%. After dealing with 3-methyladenine, the cell proliferation inhibition rate and apoptosis rate were markedly higher than that of 5-Fu only.Conclusion:The anticancer capacity of 3-methyladenine in colon cancer is weak, but it can reverse the 5-Fu-resistant in colon cancer partly, 5-Fu-induced apoptosis in 5-Fu resistant colon cancer cells may be enhanced by the inhibitor of autophagy.

colonrectal neoplasms; autophagy; 3-methyladenine; fluorouracil; drug resistance

R632.5

A

1000-2138（2014）03-0189-04

2013-10-25

溫州市科技計(jì)劃基金資助項(xiàng)目（Y2012 0012）。

胡萬(wàn)樂(lè)（1978-），女，浙江溫州人，主治醫(yī)師。通信作者：陳榮，主任醫(yī)師，副教授，Email：cr13806887833@ 163.com。