微小RNA-155反義寡核苷酸對乳腺癌MDA-MB-157細胞及裸鼠移植瘤的作用

鄭書榮，郭貴龍，黃奇迪，黃督平，尤捷，黃關立

（溫州醫科大學附屬第一醫院 腫瘤外科，浙江 溫州 325015）

微小RNA-155反義寡核苷酸對乳腺癌MDA-MB-157細胞及裸鼠移植瘤的作用

鄭書榮，郭貴龍，黃奇迪，黃督平，尤捷，黃關立

（溫州醫科大學附屬第一醫院 腫瘤外科，浙江 溫州 325015）

目的：探討微小RNA-155（microRNA-155，miR-155）反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）對乳腺癌MDA-MB-157細胞增殖、凋亡及裸鼠移植瘤的作用。方法：設計合成化學修飾的miR-155 ASO，通過LipofectamineTM2000轉染MDA-MB-157細胞，激光共聚焦檢測轉染率，real-time PCR測定轉染后miR-155表達水平的變化，CCK-8法檢測細胞增殖抑制率，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，觀察miR-155 ASO對裸鼠成瘤能力的影響，免疫組織化學法檢測瘤體組織Caspase-3的表達。結果：激光共聚焦檢測轉染率達80%以上。轉染miR-155 ASO后，miR-155表達明顯下降，細胞增殖能力降低，凋亡增加。miR-155 ASO能明顯抑制裸鼠移植瘤生長，抑制率為52.98%，并且能顯著增加Caspase-3的表達。結論：miR-155 ASO能顯著下調miR-155的表達水平，繼而抑制乳腺癌MDA-MB-157細胞的增殖，促進其凋亡；并且通過增加靶基因Caspase-3的表達，抑制裸鼠移植瘤的生長，為miR-155作為乳腺癌治療靶點提供了實驗依據。

乳腺腫瘤；微小RNA-155；反義寡核苷酸；MDA-MB-157細胞；裸鼠

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是近年來發現的一類長度為約20～24個核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，通過與靶基因完全或不完全互補結合形式來負調控基因表達，參與調節細胞的代謝、增殖、分化和凋亡等基本生理過程[1-2]。諸多研究表明miRNAs的表達異常與多種腫瘤的發生發展密切相關。乳腺癌是目前威脅婦女健康的最常見惡性腫瘤之一。我們的前期研究已證實miR-155在乳腺癌中呈高表達，并與臨床病理因素顯著相關[3]。本研究選取miR-155高表達的乳腺癌細胞株[4]，運用反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）技術觀察其對細胞生物學行為的影響，并通過裸鼠致瘤實驗，進一步探討以miR-155為靶點的干預措施對乳腺癌MDA-MB-157細胞成瘤能力的作用及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料及引物合成MDA-MB-157細胞株購自上海寶特生命科學發展有限公司，裸小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證編號：SCXK（滬）-0005。DMEM培養基及胎牛血清購自GIBCO公司。miR-155 ASO（5’-ACCCCUAUCAAGAUUAGCAUUAA-3’）和miR-155無義寡核苷酸（scrambled negative control，SCR）（5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’）購自上海GenePharma公司，部分無義寡核苷酸采用羧基熒光素（caboxyfluorescein，FAM）熒光標記。miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。轉染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所，Annexin V-FITC/ PI凋亡檢測試劑盒購自Merck公司，兔抗人多克隆抗體及免疫組織化學試劑盒（BG0023SP）購自上海藍基生物科技有限公司。

1.2 乳腺癌細胞的培養和轉染采用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養乳腺癌細胞。反義寡核苷酸轉染依試劑說明操作。采用無血清培養基分別稀釋miR-155 ASO和miR-155 SCR，然后取與寡核苷酸等體積的脂質體LipofectamineTM2000稀釋到無血清培養基中，輕輕混勻后溫育5 min，再將稀釋的LipofectamineTM2000分別與稀釋的miR-155 ASO或miR-155 SCR混合，輕輕混勻后溫育20 min。將復合物加入到含細胞的培養板中混合，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱內，6 h后更換含10%胎牛血清的培養基繼續培養48 h，進行后續實驗。

1.3 轉染率測定將已轉染FAM標記無義寡核苷酸的MDA-MB-157細胞避光培養，于轉染后8 h激光共聚焦檢測細胞轉染率。

1.4 Real-time PCR檢測轉染后miR-155表達水平

MDA-MB-157細胞培養于6孔板中，待其長至70%左右，通過LipofectamineTM2000分別轉染75 nmol/L miR-155 ASO和75 nmol/L miR-155 SCR，轉染后6 h換液。繼續培養48 h后按miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書操作提取MDA-MB-157細胞miRNAs。提取的產物立即按miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行反轉錄反應，合成的cDNA第一鏈置于-20 ℃保存。qRT-PCR反應體系為20μ L，反應條件為94 ℃2 min（，94 ℃ 20 s， 60 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s）× 40 cycle，具體參照miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書，以5SrRNA為內參。計算各標本平均CT值，將目的基因的CT值減去內參基因的CT值即為ΔCT。ΔCT越高，其表達越低。miR-155上游引物序列5’-GGTTAATGCTAATCGTGATAGGGGTAA-3’，內參5SrRNA上游引物序列5’-GTCTACGGCCATACCACCCT GAAC-3’，通用下游引物由試劑盒提供。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率實驗分6組：空白對照組、脂質體組、75 nmol/L SCR組、25 nmol/ L、50 nmol/L和75 nmol/L ASO組。置培養箱中培養48 h后，于每孔加入10μ L的CCK-8試劑，反應1 h，然后用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度（OD值），各組取均值計算細胞抑制率，細胞增殖抑制率（%）=（1-OD實驗組/OD對照組）×100%。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率按凋亡試劑盒說明書操作，以未染色細胞調零流式細胞儀。實驗分組同步驟1.5。轉染后48 h收集各組細胞懸液，加入10μ L培養基結合試劑和1.25μ L Annexin VFITC，室溫避光反應15 min，1 000 g離心5 min，去除培養基。然后用0.5 mL 1×結合緩沖液輕輕重懸并加入10 μL Propidium Iodide，立即避光送檢流式。

1.7 裸鼠成瘤實驗裸鼠飼養于溫州醫科大學實驗動物中心無菌空氣層流室，全部實驗飼養過程達到無特定病原體（specific pathogen free，SPF）條件。取對數生長期5×106細胞接種于各裸鼠一側背部皮下，建立裸鼠皮下移植瘤模型。將裸鼠隨機分為4組，每組10只。接種后1周按Li等[5]方法開始處理。實驗分為4組：空白對照組、脂質體組、75 nmol/L SCR組、75 nmol/L ASO組。1.8移植瘤的測量及獲取成瘤后每5 d測1次各組裸鼠腫瘤的大小，用游標卡尺測量腫瘤最大長徑（L）和最大橫徑（S），換算成腫瘤的體積V（cm3）= 0.5×L×S2。30 d后，拉頸處死全部裸鼠，取腫瘤觀察并測瘤質量，抑瘤率（%）=（對照組瘤質量-實驗組瘤質量）/對照組瘤質量×100%，獲取的腫瘤進行下一步實驗。

1.9 免疫組織化學染色檢測移植瘤Caspase-3表達切片常規脫蠟、水化、常溫阻斷、抗原修復，滴加正常山羊血清封閉液后滴加一抗，兔抗Caspase-3多克隆抗體（1:100稀釋），4 ℃過夜，滴加生物素化二抗，37 ℃孵育20 min，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，DAB光鏡下顯色、復染、常規脫水、透明、中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照。染色結果采用Soslow等[6]的綜合積分法并稍加改進：①陽性細胞數計分：無染色細胞為0分、1%～10%為1分、11%～50%為2分、51%～80%為3分、81%～100%為4分；②染色強度計分：胞質無染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。兩項乘積即為總分，0分為陰性（-）、1～4分為弱陽性（+）、5～8分為陽性（++）、9～12分為強陽性（+++）。

1.10 統計學處理方法采用SPSS17.0統計學軟件。兩組計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，多組間計量資料比較采用單因素方差分析和LSD多重比較方法進行檢驗；移植瘤Caspase-3表達水平差異采用Kruskal-Wallis H檢驗，組內兩兩比較采用Nemenyi法檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-155 ASO轉染率測定先轉染FAM標記的無義寡核苷酸于MDA-MB-157細胞中，轉染8 h后激光共聚焦檢測細胞轉染率，發現絕大多數細胞含有熒光，表明轉染率可達80%以上。見圖1。

圖1 激光共聚焦檢測轉染效果（×200）

2.2 miR-155 ASO抑制miR-155表達miR-155 ASO轉染MDA-MB-157細胞48 h后，運用實時定量RT-PCR檢測癌細胞中miR-155的表達水平。從PCR擴增曲線可見miR-155 ASO組CT值明顯高于SCR組（見圖2）。經分析兩組Δ CT分別為4.81±0.20和3.04± 0.09，差異有統計學意義（t=11.13，P=0.002），提示miR-155 ASO能特異性下調miR-155的表達。

圖2 miR-155 ASO特異性下調MDA-MB-157細胞中miR-155的表達水平

2.3 細胞生長抑制率檢測結果與空白對照組相比，脂質體組、75 nmol/L SCR組和25 nmol/L ASO組對MDA-MB-157細胞吸光度的影響差異無統計學意義（P值分別為0.377、0.289和0.333）。而50 nmol/ L ASO組和75 nmol/L ASO組均可顯著減少MDA-MB-157細胞吸光度（P值分別為0.005和0.000）。單因素方差分析顯示各反義寡核苷酸轉染組間OD值改變差異有統計學意義（P=0.001），組內分析示ASO濃度從25 nmol/L上升到50 nmol/L時，OD值改變顯著（P=0.032），從50 nmol/L上升到75 nmol/L時，OD值差異亦有統計學意義（P=0.001），表明miR-155 ASO濃度對細胞吸光度的影響呈劑量依賴性。總體而言，隨著ASO濃度從25 nmol/L到75 nmol/ L，MDA-MB-157細胞吸光度依次減少，細胞增殖抑制率則從6.26%增加到47.1%。見表1。

表1 CCK-8法檢測miR-155 ASO對MDA-MB-157細胞增殖的影響

2.4 細胞凋亡率檢測結果隨著miR-155 ASO濃度的增加，其促進MDA-MB-157細胞凋亡的作用逐漸增強。空白對照組幾乎未見凋亡細胞，脂質體組及75 nmol/L SCR組可見少量凋亡細胞；不同濃度miR-155 ASO處理MDA-MB-157細胞48 h，當濃度達到50nmol/L時，細胞凋亡率達到（28.6±3.77）%，以早期凋亡細胞為主，達（23.7±3.32）%；當miR-155 ASO濃度達到75 nmol/L時，細胞凋亡率達（35.6± 5.96）%，并且晚期凋亡及壞死細胞比例顯著增加，達（12.1±2.32）% ，圖3為其中一次檢測結果。2.5miR-155 ASO對裸鼠移植瘤生長的影響除空白對照組1只裸鼠未成瘤外，其余裸鼠均成瘤，成瘤率為97.5%。治療期間，各組腫瘤體積均持續增加，但與另外3組相比，miR-155 ASO組腫瘤生長明顯變緩（見圖4）。由表2可見，miR-155 ASO組腫瘤質量明顯較另外3組降低（P=0.000），腫瘤生長明顯受到抑制，抑制率為52.98%。

圖3 miR-155濃度依賴性地促進MDA-MB-157細胞凋亡

圖4 各組裸鼠腫瘤體積及生長曲線

表2 各組裸鼠腫瘤標本平均質量和腫瘤抑制率

2.6 移植瘤Caspase-3免疫組織化學檢測細胞胞質、胞核呈棕黃色為Caspase-3陽性表達細胞。如圖5所示，空白對照組移植瘤幾乎未見陽性細胞，脂質體組和75 nmol/L SCR組可見部分細胞胞質呈棕黃色，而75 nmol/L ASO組可見大量細胞呈棕褐色。Kruskal-Wallis H檢驗示各組裸鼠移植瘤Caspase-3陽性表達細胞差異有統計學意義（x2=15.22，P=0.002），Nemenyi法組內兩兩比較示75 nmol/L ASO組Caspase-3陽性表達細胞顯著高于其余3組（空白對照組：x2=34.49，P＜0.05；脂質體組：x2=9.55，P＜0.05；75 nmol/L SCR組：x2=8.17，P＜0.05）。

3 討論

近年來研究表明，miR-155在人體各種病理生理過程中起著重要的調控作用，如：炎癥[7]、免疫[8]、造血作用[9]、心血管[10]等疾病及腫瘤。miR-155的突變和異常表達與人體多種腫瘤存在相關性，是影響腫瘤發生、發展的一個重要因素。我們前期研究表明，miR-155在乳腺癌組織中呈高表達[3]，提示miR-155在乳腺癌的發生、發展中起促癌作用。

圖5 各組裸鼠移植瘤Caspase-3陽性細胞（SP，×400）

腫瘤的首要特征表現為惡性增殖、細胞增殖與凋亡失衡，因此抗增殖、促凋亡是治療腫瘤的有效策略之一。ASO是一類經人工合成或構建的反義表達載體，通過堿基互補原理結合目的基因或mRNA上特定的序列（靶核酸），從而調節細胞的生長、分化最終達到基因控制和治療目的[11]。由于反義基因治療具有高度特異性、經濟方便及不良反應小等優點，現已成為當前腫瘤治療研究熱點之一。目前，有利用針對目的微小RNA的ASO研究miRNAs在細胞中的生物學功能。Wang等[12]研究發現轉染miR-20、miR-106及miR-150 ASO可顯著抑制肺癌細胞A549的增殖并促進其凋亡。Si等[13]觀察到體外乳腺癌細胞株中轉染miR-21 ASO后可促進癌細胞的凋亡、抑制其增殖，并且可以抑制裸鼠移植瘤生長。有研究證實miR-155 ASO在淋巴干樣細胞株（lymphoblastoid cell lines，LCLs）中亦有類似作用[14]。

本研究首先探討miR-155對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響，選取miR-155高表達的乳腺癌細胞株MDA-MB-157作為研究對象。將FAM標記的75 nmol/ L miR-155 SCR轉染細胞，經激光共聚焦顯微鏡下觀察轉染率，發現絕大多數細胞可見綠色熒光標記，表明轉染效果達到實驗要求。采用Real-time PCR方法發現miR-155 ASO可顯著降低MDA-MB-157細胞miR-155的表達水平。CCK-8實驗檢測細胞增殖抑制率結果提示各ASO組的細胞存活率低于空白對照組，當ASO的濃度達到75 nmol/L時，細胞增殖抑制率顯著增高。應用Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡，結果發現各ASO組細胞凋亡明顯增加。當ASO濃度達到50 nmol/L時，早期凋亡細胞比例明顯增加；濃度達到75 nmol/L時，晚期凋亡及壞死細胞比例顯著增加。以上結果表明miR-155 ASO可抑制MDAMB-157細胞的增殖并可促進其凋亡。

本研究進一步通過裸鼠致瘤實驗探討了miR-155 ASO在體內是否對乳腺癌細胞具有相類似作用。結果發現處理1個月后，miR-155 ASO組裸鼠腫瘤生長較空白對照組、脂質體組及SCR組明顯減慢；平均體積及平均質量均顯著低于另外3組（P＜0.05）。表明miR-155 ASO在體內可有效抑制腫瘤的生長，提示miR-155的高表達可能促進乳腺癌細胞增殖，與Zhu等[3]研究發現一致。

細胞凋亡是一個由Caspase家族成員介導的復雜的蛋白酶級聯反應過程。在Caspase家族中，Caspase-2、8、9、10等處于上游，Caspase-3、6、7處于下游，其中Caspase-3、7是細胞凋亡最后的共同途徑。與多數蛋白酶一樣，Caspases以無活性的酶原形式存在，細胞凋亡是由Caspases酶原的活化而引發的。Caspases的激活通過級聯反應模式，即相關信號蛋白激活Caspases-8，引起Caspases級聯反應，最后激活Caspascs-3，其作為細胞凋亡的最后執行者，是細胞凋亡蛋白級聯反應的必經之路，是所有凋亡途徑的最后效應子，它激活DNA酶，裂解DNA成碎片，導致細胞凋亡。

為了探討miR-155 ASO促進腫瘤細胞凋亡的可能作用機制，本研究通過免疫組化檢測各組裸鼠移植瘤中Caspase-3的表達情況。研究發現空白對照組移植瘤幾乎未見Caspase-3蛋白表達，SCR組和脂質體組可見少量陽性細胞表達，而ASO組可見大量Caspase-3陽性表達細胞。Caspase-3作為細胞凋亡中最關鍵的酶，其活化表達將引起細胞不可逆的凋亡，是細胞凋亡的標志[15]，提示miR-155 ASO可通過上調Caspase-3的表達而誘導細胞凋亡，發揮抗腫瘤的作用。Wang等[16]研究腰椎間盤變性時發現，上調miR-155可降低Caspase-3的表達，而敲除miR-155則可上調Caspase-3表達，進一步通過雙熒光素酶報告顯示Caspase-3為miR-155的靶基因之一。

綜上所述，miR-155 ASO可抑制乳腺癌MDA-MB-157細胞的增殖、促進其凋亡，并且抑制裸鼠移植瘤的生長。利用miR-155 ASO有可能成為治療乳腺癌的一個新的研究方向。

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（本文編輯：吳健敏）

Effects of antisense oligonucleotide targeting microRNA-155 on breast carcinoma cell line MDA-MB-157

and the implanted tumor in nude mice

ZHENG Shurong, GUO Guilong, HUANG Qidi, HUANG Duping,YOU Jie, HUANG Guanli.Department of Oncological Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To explore the effects of antisense oligonucleotide targeting miR-155 on proliferation and apoptosis in MDA-MB-157 cells and the growth of implanted tumor in nude mice.Methods:2’Ome modified antisense oligodeoxynucleotide targeting miR-155 was synthesized and then transfected into MDAMB-157 cells by LipofectamineTM2000. Transfection efficiency was detected by laser confocal microscope. Realtime RT-PCR method was used to detect the expression of miR-155. Cell counting Kit-8 (CCK-8) assay was used to detect the proliferation of MDA-MB-157 cells and cell apoptosis rate was measured by flow cytometry. The effects of miR-155 Antisense oligonucleotide (miR-155 ASO) on the transplanted tumor were assessed in nude mice.Results:Transfection efficiency detected by laser confocal microscope was higher than 80%. The level of miR-155 expression was significantly decreased (P<0.05) in the cells transfected with miR-155 ASO, compared with that in cells transfected with negative control. After being transfected with miR-155 ASO, the viability of MDA-MB-157 cells reduced greatly (P<0.05) and the number of apoptotic cells increased significantly. Additionally, miR-155 ASO inhibited the growth of transplanted tumor in vivo (inhibition ratio=52.98%) and significantly increased the expression of caspase-3.Conclusion:miR-155 ASO can effectively down-regulate the expression of miR-155, induce cell apoptosis and inhibit cell proliferation and tumor growth by increasing the expression of caspase-3. These findings provide the experimental evidence for using miR-155 as a therapeutic target of breast carcinoma.

breast neoplasms; microRNA-155; antisense oligonucleotide; MDA-MB-157 cells; nude mice

R73

A

1000-2138（2014）03-0183-06

2013-03-19

鄭書榮（1985-），男，浙江泰順人，住院醫師，碩士。

郭貴龍，主任醫師，碩士生導師，Email：guogui long@sina.com。