CYP1B1與北方地區漢族人群喉癌易感性多基因關聯分析

林發明，金建華，薛靜，包其郁，劉朝兵，倪麗艷

（1.溫州醫科大學附屬第二醫院 耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學 基礎醫學院，浙江 溫州 325035；3.河北石家莊第一醫院 耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050011；4.溫州醫科大學生命科學院，生物醫學信息研究所/浙江省醫學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325035；5.河北省眼科醫院 耳鼻咽喉科，河北 邢臺 054001）

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，且發病率呈逐年上升趨勢[1]。喉癌的發病原因尚未明確，目前認為是由以環境和遺傳因素為主的多因素綜合作用的結果，從腫瘤分子遺傳學角度研究與喉癌相關的遺傳因素，并通過關聯性分析，篩選可能的易感基因，對揭示喉癌的發病機制具有重要的意義。CYP1B1能將多環芳香烴、雜環胺等多種前致癌物的代謝激活[2-3]，形成具有活性的細胞毒性物質和DNA中間體，是腫瘤易感性的可能發病風險機制[4-5]。現已證實至少有50個能夠影響CYP1B1蛋白編碼的多態性位點，而在這其中142C/G、355G/T（CYP1B1*2），4326C/G（CYP1B1*3），4390 A/G（CYP1B1*4）四個多態性位點能夠引起相應氨基酸的改變影響代謝酶對致癌物的代謝活性[6-7]。本研究通過病例對照研究方法來分析CYP1B1三個重要多態位點CYP1B1*2 142C/G、355 G/T，CYP1B1*3 4326C/G遺傳變異與喉癌易感性的關系，為喉癌高危人群的預防及早期診斷等提供重要線索。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2007年8月至2011年8月河北石家莊第一醫院以及河北省眼科醫院診斷為喉癌的200例喉癌患者作為病例組，入選標準：①原發灶經組織病理學診斷為喉鱗狀細胞癌；②取血標本前未經放化療；③血標本保存完整；④臨床資料齊全；⑤均為漢族人群且相互之間無血緣關系。對照組選取同一時期經上述兩家醫院體檢中心體檢為健康人群200例，入選標準除包含上述②～⑤條標準外還需含：①經體檢無腫瘤及腫瘤病史；②無家族腫瘤遺傳史；③無職業性接觸放射線物質、有毒氣體等致癌物史。對照組按性別和年齡與患者頻數配對，兩組在年齡、性別方面差異均無統計學意義（分別P=0.150、P=0.792）。本試驗經溫州醫科大學附屬第二醫院學術倫理委員會討論通過。受試者本人均知情同意。

1.2方法

1.2.1 引物的設計：多重PCR引物及延伸引物由SEQUENOM公司Assay Design 3.1程序設計，由北京擎科公司合成PCR引物及延伸引物序列（見表1）。1.2.2 基因組DNA提取：抽取受試者肘靜脈血標本3～4 mL加入EDTA抗凝管中，于-70 ℃低溫保存。使用AxyPrep全血基因組DNA試劑盒（AxyPrep愛思進科學有限公司）提取DNA。

1.2.3 基因擴增與分型：①儀器與試劑：Applied Biosystems公司的GeneAMP PCR System 9700；MassARRAY Compact System；②PCR及SNP分型：通過多重PCR技術實現對所選的SNP位點的基因序列進行擴增（反應條件：95 ℃預變性2 min，經95℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s 45個循環，72 ℃延伸5 min）。將上述擴增產物中加入SAP酶純化并加入ddNTP，通過延伸引物來實現SNP位點的擴增（反應條件：①94 ℃預變性30 s，②94 ℃變性5 s，③52 ℃退火5 s，④80 ℃延伸5 s，③、④循環5次，然后②～④循環40次，⑤72 ℃延伸3 min）。延伸完畢后，產物通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）基因分型技術，進行SNP分型。

表1 各單核苷酸引物及延伸引物

1.3 煙酒量評估 吸煙用吸煙指數（smoking index，SI。SI=每天吸煙支數/20×吸煙年數）來評估，年包在20以下（含20）為輕吸煙者，大于20為重吸煙者[8]。同樣飲酒按飲酒指數（drinking index，DI。DI=每天飲酒毫升×飲酒年數）來評估，分為少量飲酒者（DI≤60）和大量飲酒者（DI＞60）[9]。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析。應用Hard-weinberg平衡檢驗病例組及對照組CYP1B1基因型和等位基因頻率分布是否具有群體代表性。Haploview 3.2軟件（http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/）進行單倍體分析：包括單倍體構建，連鎖不平衡性的評估。采用四格表x2檢驗檢驗基因型和等位基因頻率之間的差異，分別用logistic回歸和非條件logistic回歸模型計算各基因型與喉癌風險的OR值、95%可信區間（95%CI），以及調整后值。非條件logistic回歸模型計算CYP1B1個位點之間的聯合作用以及與吸煙、飲酒及聯合作用。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料特征 病例組與對照組危險因素的分布情況見表2。在病例組中男性患者（約占96%）明顯較女性多，差異有統計學意義（P＜0.001）。大部分喉癌患者具有長期的吸煙、飲酒史：病例組中吸煙人數所占比例（為86.0%）比對照組（為65.6%）明顯要高（P＜0.001），重吸煙組人群喉癌風險顯著增加且差異有統計學意義（OR:5.065，95%CI:3.386～7.575，P＜0.001），輕吸煙組差異無統計學意義（OR:1.452，95%CI:0.921～2.288，P=0.108）；同樣，在病例組中飲酒人數（為67.0%）要高于對照組（為48.5%）（P＜0.001），并且在大量飲酒組中喉癌風險明顯增高，二者之間差異有統計學意義（OR:3.789，95%CI: 2.674～5.370，P＜0.001），而在少量飲酒組中差異無統計學意義（OR:0.926，95%CI:0.617～1.390，P=0.711）。

表2 煙酒等危險因素在病例組與對照組中的分布（n=200，±s，n/%）

表2 煙酒等危險因素在病例組與對照組中的分布（n=200，±s，n/%）

注：Ref.：參考類別

變量年齡（歲）性別病例組37～92（63.13±10.238）對照組44～89（63.20±9.330）OR（95%CI）P 0.150 0.792男 女192/0.96 8/0.04 193/0.96 7/0.04吸煙狀態非吸煙吸煙（SI）≤20＞20飲酒狀態非飲酒飲酒（DI）≤60＞60 28/14.0 172/86.0 26/0.27 146/0.73 66/33.0 134/67.0 33/16.5 101/50.5 69/34.4 131/65.6 67/67.8 64/32.2 103/51.6 97/48.5 55/27.5 42/21.0 1（Ref.）1.452（0.921～2.288）5.065（3.386～7.575）1（Ref.）0.926（0.617～1.390）3.789（2.674～5.370）＜0.001 0.108＜0.001＜0.001 0.711＜0.001

2.2 等位基因和基因型的分布 三個多態性基因位點基因型及等位基因頻率見表3。所有樣本均符合Hardy-weinberg平衡（P＜0.05），所選樣本具有群體代表性。在病例組和對照組中等位基因CYP1B1*2 142G、355T及CYP1B1*3 4326G比率分別為17.8%、36.5%、8.8%和20.0%、30.2%、11.8%。CYP1B1*2 355G/T和CYP1B1*3 4326C/G基因型在兩組之間差異有統計學意義（分別P＜0.001，P=0.007），二者雜合子基因型與對照組相比差異具有統計學意義（頻率分別為74.0%、54.5%，P＜0.001；22.5%、13.5%，P=0.004）。

2.3 單核苷酸多態性位點與喉癌的關系 攜帶CYP1B1*2 355G/T突變型等位基因T的病例組患病風險高于對照組（crude OR=2.022，95%CI:1.376～2.971，P＜0.001），差異有統計學意義。經年齡、性別、吸煙及飲酒等因素校正后差異仍有統計學意義（Adjusted OR=2.281，95%CI:1.142～3.516，P＜0.001）。

與CYP1B1*2 355G/T相反，攜帶CYP1B1*3 4326C/G突變等位基因G的病例組患病風險要低于對照組（crude OR=0.605，95%CI: 0.410～0.894，P=0.012）。經年齡、性別、吸煙及飲酒等因素校正后差異仍有統計學意義（Adjusted OR=0.571，95%CI:0.370～0.882，P=0.011.）。

CYP1B1*2 142C/G各基因型在病例組與對照組中差異無統計學意義（P=0.265），與喉癌患病風險無明顯相關性。

2.4 基因聯合作用與喉癌風險的關系 基因聯合作用對喉癌易感性的影響見表4。在可能的8種單倍體構型中構建出7種單倍體型，其中只有兩種與喉癌發病風險有關。最常見的單倍體型是C142G355C4326在病例組與對照組中分別占60.8%、64.7%。C142T355C4326相對C142G355C4326單倍體型患病風險顯著增加（Adjusted OR=3.180，95%CI:1.760～5.746，P＜0.001）。

表3 多態性基因型在病例對照組中的分布（n=200，n/%）

表4 單倍體型組合在病例組和對照組中的分布（n=400，n/%）

2.5 基因和環境因素的聯合作用與喉癌風險的關系 三個多態性基因位點分別與吸煙飲酒的聯合作用對喉癌患病風險的影響見表5。在非吸煙組中，攜帶CYP1B1*2 355G/T基因型GT+TT患病風險度OR為2.080（95%CI: 0.742～5.830）；在吸煙組中其相應風險度OR為6.322（95%CI: 2.541～15.725，P＜0.001），與吸煙和基因單因素下分別對喉癌危險度相乘OR值近似（3.046×2.080=6.336）。在非飲酒組中，攜帶CYP1B1*2 355G/T基因型GT+TT患病風險度OR為2.094（95%CI: 1.056～4.135）；在飲酒組中其相應風險度OR為3.997（95%CI: 2.098～7.613，P＜0.001），與飲酒和基因單因素下分別對喉癌危險度相乘OR值近似（1.931×2.094=4.044）。以上數據均未顯示CYP1B1*2 355G/T基因多態性和吸煙、飲酒與喉癌對患病風險的增加不表現相互協同作用。同時也未發現CYP1B1*2 142C/G、CYP1B1*3 4326C/G多態性基因位點與吸煙、飲酒的聯合效應在喉癌患病風險中的作用（數據未完全列出）。

表5 基因與煙酒的相互作用對喉癌患病風險的影響（n=200，n/%）

3 討論

本次針對中國北方人群的病例對照研究顯示CYP1B1*2 355G/T、CYP1B1*2 4326C/G基因的多態性與喉癌的發生風險有密切關系。CYP1B1*2 355G/T突變型等位基因T與喉癌患病風險呈正相關，CYP1B1*3 4326C/G突變型等位基因G能夠降低喉癌的患病風險，具有一定的保護效應。

CYP1B1*2 355G/T多態性位點位于染色體2p21-22第二個外顯子上，其等位基因的變異能夠引起相應的氨基酸Ala向Ser改變。Singh等[10]研究表明CYP1B1*2 C355T變異與頭頸部腫瘤相關，其突變型基因型能夠增加頭頸部腫瘤的患病風險。Jawarowska等[11]也發現CYP1B1*2 355T等位基因能夠增加喉癌的患病風險。Shah等[12]指出CYP1B1*2 355T在肺鱗狀細胞癌患者中高表達，對肺癌的易感性增加具有重要意義。本次研究同樣發現攜帶CYP1B1*2 355T突變體受試者患病風險較野生型明顯增加。所有以上資料顯示CYP1B1*2 G355T是喉癌的危險基因，其突變體基因型能夠增加喉癌患病風險。但是其作用機制尚不十分明確。

CYP1B1*3 4326C/G多態性位點位于染色體2p21-22第三個外顯子上，其等位基因的變異能夠引起相應的氨基酸Leu向Val改變。Church等[13]研究表明攜帶突變型等位基因的吸煙者顯著增加患肺癌風險，但該基因位點多態性與肺癌易感性關系尚不明確，Tai等[8]認為其多態性與下咽癌、喉癌易感性無相關性，但是Trubicka等[14]研究數據顯示在直腸癌患者中攜帶突變體G的基因型的表達水平明顯較正常對照組低，表明突變型等位基因的存在可能降低直腸癌的患病風險，對易感人群具有保護效應。這也與本研究結果相一致：CYP1B1*3 4326C/G雜合子基因型在病例組中表達顯著降低，提示該突變位點的等位基因發生C→G突變時對降低喉癌患病風險具有保護作用。這種結果的差異可能與不同種族之間的基因構成或者有其他混雜因素如其他多態性基因位點的影響造成，還有可能與統計樣本容量相關。

同時我們沒有發現CYP1B1*2 142C/G多態性位點與喉癌具有相關性，在其他腫瘤如卵巢癌的研究[15]中也未發現具有相關性，提示雖然CYP1B1*2 142C/G位點的變異能夠引起氨基酸Arg轉變為Gly，但是并不改變相應酶的活性。

單倍體分析表明，C142G355C4326是最常見的單倍體構型，這在其他研究資料中鮮見報道。單基因分析顯示CYP1B1*2 G355T突變型基因是喉癌的危險基因，CYP1B1*3 4326C/G突變型基因是喉癌的保護基因，與此同時可以假設CYP1B1*3 4326C/G野生型基因位點為相對危險基因。本次聯合基因的分析發現C142T355C4326單倍體型較其他單倍體構型患喉癌風險顯著增加，且其風險度亦比單基因分析時高，C142G355G4326單倍體型與常見單倍體型C142G355C4326相比其患喉癌發現有所降低。表明隨著危險及相對危險位點的增多其患喉癌危險度也不斷增加，反之隨著保護及相對保護位點的增多其患喉癌危險度逐漸降低。此次分析也進一步證實CYP1B1*2 355T是喉癌患病的危險等位基因，CYP1B1*3 4326G是喉癌患病的保護等位基因。

喉癌流行病學資料表明環境因素是腫瘤的重要病因，其中煙酒尤為重要。煙草中的前致癌物環芳烴、雜環胺、芳香胺和硝基多環烴以及酒精代謝產物乙醛經CYP1B1代謝酶活化形成致癌物質[16]，激活癌基因。我們研究結果顯示吸煙、飲酒尤其是重度吸煙、重度飲酒者患喉癌風險顯著增加，進一步證實煙酒是喉癌的危險因素。但是在對基因-環境聯合因素與喉癌風險度分析中，并沒有發現聯合作用對喉癌風險度的增加。Soucek等[17]也未發現煙草與基因對頭頸部腫瘤有相互協同效應。以上分析及資料顯示，煙酒以及CYP1B1*2 355G/T，CYP1B1*3 4326C/G多態性基因位點與喉癌患病風險相關，但是聯合研究環境-基因因素對喉癌患病風險的影響時，二者間不表現相互協同效應，表明二者是喉癌的獨立危險因素。這提示煙酒并不影響上述多態性基因位點的改變，二者之間不存在協同效應[18]。

總之，本次研究表明CYP1B1基因的多態性與喉癌患病風險密切相關。單基因及多基因聯合分析進一步證實CYP1B1*2 355G/T突變型基因是喉癌的風險基因，CYP1B1*3 C355G突變型基因是喉癌的保護基因，聯合風險基因越多患癌風險越大。環境因素（煙酒）在喉癌的發生中扮演著重要作用，煙酒接觸越多危害越大，環境-基因之間的聯合作用并不增加喉癌患病風險。

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