N-乙?；D移酶2及谷胱甘肽S轉移酶M1基因多態性與抗結核藥物性肝損傷的關系研究

安慧茹 吳雪瓊 王仲元

結核病是一種全球性的公共健康問題，異煙肼(H)、利福平(R)、吡嗪酰胺(Z)是治療結核病的主要藥物。然而，它們均具有肝毒性，且三者聯用可以導致肝損傷的可能性增加[1]。而藥物性肝損傷的發生常常使患者被迫中斷甚至終止治療，導致治療效果差、結核病復發和產生耐藥，給結核病的控制帶來不利影響。了解這些藥物引發肝損傷的危險因素和機制，對降低抗結核藥物性肝損傷的發生率和控制結核病疫情都非常必要。藥物性肝損傷應與該藥在肝中代謝毒物產生及排除有關，因此，藥物代謝酶的多態性應與抗結核藥物的肝損傷密切相關。

N-乙?；D移酶2(N-acetyltransferase 2，NAT2)在肝臟中參與包括H、R在內的一線抗結核藥物的代謝。NAT2的編碼基因位于第8對常染色體的短臂2區2帶，該基因多態性與NAT2酶活性密切相關。H通過NAT2的乙?；饔蒙梢阴．悷熾?后者水解為異煙酸和乙酰肼，乙酰肼一部分進一步水解為肼，一部分在NAT2酶的作用下生成無毒物質排出體外。肼及乙酰肼已被認定是肝毒性物質，可以導致藥物性肝損傷的發生[2-3]。因此，NAT2活性可能影響乙酰肼乙?；蔁o毒物質的比例。R具有誘導肝臟多種代謝酶的作用[4],其不僅在肝中去乙?；癁楫悷熾乱阴；峁┮阴；铱烧T導肝藥酶活性，加速乙酰異煙肼代謝為乙酰肼，從而增加異煙肼的肝毒性。這些過程均與NAT2酶活性相關。

谷胱甘肽S-轉移酶(GST)是1種多功能的參與體內生物轉化的Ⅱ相解毒代謝酶,在很多外源性化合物和藥物的解毒代謝中起重要作用。編碼GST的人類GST基因是1個超基因家族,已分離出Alpha(A，GSTA)、Mu(M，GSTM)、Theta(T，GSTT)和pi(P，GSTP)4個亞家族。人類GST基因決定谷胱甘肽S-轉移酶活性，能催化還原型的谷胱苷肽(GSH)的巰基(-SH)結合到疏水的化合物上,使親電子的化合物變成親水的物質,易于從膽汁或尿液中排泄,通過這種方式將體內各種致癌物和斷裂劑產生的親電子試劑、有潛在毒性的物質及親脂性化合物降解排出,因此GST在機體代謝有毒化合物、保護細胞免受急性毒性化學物質攻擊和抑制細胞癌變中起著重要的作用[5]。Strange等[6]研究報道GSTM1、GSTT1基因缺失可導致酶活性喪失。Watanabe等[7]研究發現GSTM1、GSTT1聯合缺失可導致曲格列酮的肝毒性明顯增加。以上研究表明，NAT2、GSTM1的基因多態性的研究，對于闡明抗結核藥物性肝損傷的分子機制具有一定的意義。

本研究擬通過聚合酶鏈反應-直接測序(PCR-DS)及多重PCR的方法研究中國人群NAT2、GSTM1、GSTT1基因多態性與抗結核藥物誘導肝損傷關系的相關性，以進一步闡明抗結核藥物肝損傷的分子機制。

材料和方法

一、患者來源

1.患者的選擇標準：所有進入本研究的患者應滿足以下條件：(1)均接受一線抗結核藥物H、R、Z、乙胺丁醇(E)的治療，方案如下： 2HRZE/4HR，藥物劑量按照體質量(kg)計算，如有藥物性肝損傷的發生，方案根據情況隨時調整，同時該例患者歸為肝損傷組。(2)無營養不良、HIV感染、嗜酒、乙型或丙型等病毒性肝炎、肝病、嚴重結核病、心功能不全、合并其他藥物的使用等可以導致肝功能損害的因素的存在。(3)治療前肝功能正常，治療過程中即治療6個月內能密切監測肝功能的變化。(4)肝功能損害符合藥物性肝損傷診斷標準[8]，即血清丙氨酸轉氨酶(ALT)或天冬氨酸轉氨酶(AST)高于正常水平的2倍以上，和(或)堿性磷酸酶(ALP)高于正常1.5倍以上；和(或)膽紅素升高伴有惡心、嘔吐等消化道癥狀者。符合藥物性肝損傷的診斷標準，同時除外使用其他藥物和疾病引起肝功能異常的情況，因此，只要以上條件滿足即可診斷為抗結核藥物性肝損傷。

2.患者分組：經解放軍第三〇九醫院倫理委員會審核通過，研究對象知情，并簽署知情同意書，采用病例-對照研究方法，選擇2008—2009年度滿足上述條件的我院初治住院結核病患者208例，選取本科明確抗結核藥物性肝損傷發生的所有患者為肝損傷組(共101例)，選取無抗結核藥物性肝損傷發生的患者為對照組(共107例)，所有患者治療的前2個月每周檢測患者ALT、AST、直接膽紅素(DBIL)、總膽紅素(TBIL),之后每月檢測1次，當有惡心、嘔吐、厭食等消化道癥狀時隨時檢測患者肝功能指標。ALT,AST檢測采用IFCC(International Federation of Clinical Chemistry)速率法，單位IU/L,DBIL，TBIL檢測采用釩酸氧化法,單位μmol/L。

肝損傷組，男56例，女45例；對照組，男75例，女32例。肝損傷組，年齡15～64歲，平均年齡(36.00±15.72)歲；對照組，年齡18～61歲，平均年齡(33.36±16.71)歲，兩者比較差異無統計學意義(t=1.172，P>0.05)。用藥前肝損傷組患者血清ALT(21.47±14.29)IU/L、AST(21.56±10.93)IU/L、DBIL(4.31±1.99)μmol/L、TBIL(11.65±4.71)μmol/L；對照組ALT(23.95±12.91)IU/L、AST(19.72±9.81)IU/L、DBIL(3.87±2.33)μmol/L、TBIL(11.84±4.83)μmol/L，兩組比較t值分別為1.314、1.278、1.475、0.281，P值均>0.05，差異無統計學意義。用藥后,肝損傷組ALT(292.85±141.43)IU/L、AST(219.82±162.13)IU/L、DBIL(16.95±29.41)μmol/L、TBIL(26.82±26.19)μmol/L；對照組ALT(32.26±18.17)IU/L、AST(24.09±15.39)IU/L、DBIL(4.48±2.55)μmol/L、TBIL(11.88±4.96)μmol/L，兩組比較t值分別為4.835、7.492、4.250、5.637，P值均<0.001，差異有統計學意義。

二、操作方法和步驟

1.基因組DNA的提?。翰杉鲜鰞山M患者晨起空腹靜脈血2 ml于含有檸檬酸抗凝劑的試管中，置于-40 ℃儲存備用。常溫溶解凍存血液，使用全血基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，DP304試劑盒)，按照說明書提取1 ml靜脈血中的基因組DNA，溶解于0.1×TE緩沖液，置于-20 ℃儲存備用。

2.NAT2基因檢測：(1) 引物的設計與合成：從www.ncbi.nlm.nih.gov數據庫中獲得NAT2基因序列，利用Oligo 6.0軟件設計上游引物5′-TGAA AGAATTGGCTATAAGA-3′；下游引物5′-CAA AATAACGTGAGGGTAGAG-3′，上海生工生物技術有限公司合成，該對引物可擴增NAT2基因編碼區及其下游基因共951 bp片段。(2) PCR擴增：在50 μl 反應體系中,4 種dNTP的終濃度為0.2 mmol/L,引物的終濃度各為0.3 mmol/L，DNA 模板10～100 ng,Taq DNA聚合酶1 U。擴增參數為94 ℃變性1 min, 52 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35個循環后72 ℃延伸7 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

3.NAT2基因測序與基因型分析：上述擴增產物50 μl送上海生工生物技術有限公司測序。利用http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行測序結果的序列比對，并根據http://nat.mbg.duth.gr/Human%20NAT2%20alleles_2013.htm提供的信息及參照Huang等[2]、Cho等[9]進行測序結果的NAT2基因型分析。

4.GSTM1、GSTT1基因檢測及基因型分析：(1)GSTM1、GSTT1引物來源：參照文獻[10]的報道,GSTM1上游引物：5′-GAACTCCCTGAAAA GCTAAAGC-3′，GSTM1下游引物：5′-CTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3′，該對引物擴增產生219 bp片段。GSTT1上游引物：5′-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3′，GSTT1下游引物：5′-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3′，擴增產物459 bp。β-球蛋白上游引物：5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′，β-球蛋白下游引物：5′-GAAGA GCCAAGGACAGGTAC-3′，擴增產物268 bp。(2)PCR擴增：在50 μl 反應體系中,4 種dNTP的終濃度為0.2 mmol/L,引物的終濃度各為0. 3 mmol/L，DNA 模板10～100 ng,Taq DNA聚合酶1 U。擴增參數為94 ℃變性40 s, 52 ℃退火1 s,72 ℃延伸1 min,35個循環后72 ℃延伸7 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。(3)GSTM1、GSTT1基因擴增產物分析：用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。以β-球蛋白上下游引物擴增陽性為參照，若產生219 bp片斷說明GSTM1為非缺失基因型，否則為缺失基因型；若產生459 bp片斷說明GSTT1為非缺失基因型，否則為GSTT1缺失基因型。

三、統計學分析

結 果

一、NAT2基因多態性

本研究共發現8個基因多態性位點，包括基因編碼區190 C→T，282 C→T，341 T→C，481 C→T，499 G→A，590 G→A，803 A→G，857 G→A，除282多態性位點不導致氨基酸改變外，其余均引起氨基酸替換。各個位點堿基分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，表明樣本來自遺傳平衡群體，有較好的代表性。

二、NAT2乙酰化基因型與抗結核藥物性肝損傷的關系

依據藥代動力學乙酰化速率的不同可將人群NAT2基因分為快乙酰化基因型、中乙酰化基因型和慢乙酰化基因型。本研究根據http://nat.mbg.duth.gr/Human%20NAT2%20alleles_2013.htm提供的信息(部分信息見表1)對NAT2基因測序結果進行基因型分析，發現肝損傷組101例患者中，61例(60.4%)為NAT2快、中乙酰化基因型，40例(39.6%)為NAT2慢乙酰化基因型；對照組107例患者中，94例(87.9%)為NAT2快、中乙?；蛐?，13例(12.1%)為NAT2慢乙?；蛐?，兩者比較，基因型分布差異具有統計學意義(χ2=20.62，P<0.05)。尤其NAT2*5B/7B、NAT2*6A/7B、NAT2*6A/6A慢乙?；蛐驮趦山M中分布差異具有統計學意義(χ2值分別為4.32、14.90、6.40，P值均<0.05)。NAT2*5B/7B基因型患者4例均發生了抗結核藥物肝損傷。NAT2*6A/7B、NAT2*6A/6A基因型患者發生抗結核藥物肝損傷OR值分別達到8.40(95%CI=2.85～24.73)、4.67(95%CI=1.42～15.44)(表2)。

表1 NAT2基因型與堿基改變及氨基酸變化之間的對應關系

表2 各乙酰化基因型分布和發生抗結核藥物性肝損傷的關系

三、GSTM1、GSTT1基因多態性

GSTM1缺失基因型占57.7%(120/208)，GSTT1缺失基因型占46.6%(97/208)。部分PCR產物2%瓊脂糖電泳圖譜見圖1。

M：DNA相對分子質量標準(1100,1000,900,800,700,600,500, 400,300,200,100 bp)；陰：陰性對照，樣本編號1～23為部分患者DNA的擴增產物

四、GSTM1及GSTT1基因型與抗結核藥物性肝損傷關系

肝損傷組GSTM1缺失基因型占63.4%(64/101)，GSTM1非缺失基因型占36.6%(37/101)；對照組GSTM1缺失基因型占51.4%(55/107)，GSTM1非缺失基因型占48.6%(52/107)，利用χ2檢驗處理，兩組比較GSTM1缺失基因型發生藥物性肝損傷OR值偏高，為1.64(95%CI=0.94～2.84，P>0.05)。肝損傷組GSTT1缺失基因型占47.5%(48/101)，GSTT1非缺失基因型占52.5%(53/101)，對照組GSTT1缺失基因型占45.8%(49/107)，GSTT1非缺失基因型占54.2%(58/107), 利用χ2檢驗處理，兩組比較OR值接近(P>0.05)(表3)。

五、NAT2基因型與GSTM1基因型聯合作用與抗結核藥物性肝損傷關系

同時具有NAT2慢乙?；蛐图癎STM1缺失基因型的患者發生抗結核藥物性肝損傷的OR值高達10.21(95%CI=3.87～26.96，P<0.05),高于只具有NAT2慢乙?；蛐?OR=4.74；95%CI=2.42～9.28,P<0.01)或GSTM1缺失基因型(OR=1.64；95%CI=0.94～2.84,P>0.05)的患者(表4)。

討 論

藥物代謝酶在藥物代謝過程中起著非常關鍵的作用，這些酶的基因多態性影響著酶的活性，與藥物性肝損傷密切相關[3，11]。

早期有報道，認為NAT2快乙酰化型患者更容易發生抗結核藥物性肝損傷[12]。之后，較多報道認為慢乙?；蛐突颊咭子诎l生抗結核藥物性肝損傷[12-13]，但近來也有學者認為NAT2乙?；蛐团c抗結核藥物性肝損傷的發生無關[14]。鑒于上述報道的不同，有必要進一步研究國人NAT2乙?；蛐图捌浠蚨鄳B性與抗結核藥物性肝損傷之間的關系。

本研究發現，NAT2慢乙?；蛐团c抗結核藥物性肝損傷密切相關，其中NAT2*6A/7B、NAT2*6A/6A基因型者在兩組中分布差異有統計學意義，發生抗結核藥物性肝損傷的OR值分別為8.40、4.67,這與國外許多學者的報道一致[2,13-14]。Huang等[2]通過對224例接受抗結核藥物治療的結核病患者的研究發現，與快乙?；蛐突颊呦啾?，慢乙?；蛐突颊咧械腘AT2*6/6、NAT2*6/7基因型發生藥物性肝損傷的OR值為4.02，差異有統計學意義。Possuelo等[13]也報道NAT2*6/6，基因型者在使用抗結核藥物后，肝損傷組和無肝損傷組的分布差異具有統計學意義，其發生抗結核藥物性肝損傷的OR值為5.7。Higuchi等[14]也發現NAT2*6A/7B基因型者易于發生抗結核藥物性肝損傷。Wang等[15]對14篇中外文獻數據進行總結，對照分析了474例抗結核藥物性肝損傷患者及1446例未發生藥物性肝損傷的患者，發現與NAT2快乙?；蛐捅容^，NAT2慢乙?；蛐桶l生抗結核藥物性肝損傷的OR值為4.697，差異有統計學意義；通過亞群分析發現，在亞洲人群和非亞洲人群中，NAT2慢乙?；蛐透子诎l生抗結核藥物性肝損傷。這也更加證實了NAT2慢乙酰化基因型與抗結核藥物性肝損傷密切相關。

表3 GSTM1及GSTT1基因型與抗結核藥物性肝損傷關系

表4 結核病患者NAT2及GSTM1基因型聯合作用與抗結核藥物性肝損傷的關系

Huang等[10]對中國臺北人群有、無抗結核藥物性肝損傷的各115例患者進行對照研究發現：GSTM1缺失基因型發生抗結核藥物性肝損傷的OR值為2.23(P=0.033)，與抗結核藥物性肝損傷密切相關。Leiro等[16]對西班牙35例抗結核藥物性肝損傷及60例無肝損傷患者的GSTM1及GSTT1基因型的多態性進行研究發現：GSTT1缺失基因型發生抗結核藥物性肝損傷的OR值為2.60(P=0.03),GSTM1缺失基因型發生抗結核藥物性肝損傷的OR值為0.73(P=0.48)。本研究發現GSTT1、GSTM1缺失基因型與抗結核藥物性肝損傷無關，這與Monteiro等[17]、Tang等[18]的研究一致。Monteiro等[17]對117例接受抗結核藥物治療的結核病患者的研究發現，藥物性肝損傷的發生率為33.3%；GSTT1、GSTM1缺失基因型與抗結核藥物性肝損傷無關,但與GSTM1非缺失基因型相比，具有GSTM1缺失基因型的患者服用抗結核藥物后發生肝損傷更嚴重。Tang等[18]對89例發生藥物性肝損傷的涂陽肺結核患者和未發生抗結核藥物性肝損傷的涂陽肺結核患者的對照研究發現，GSTT1、GSTM1缺失基因型與抗結核藥物性肝損傷無關。上述研究關于GSTM1、GSTT1基因多態性與抗結核藥物性肝損傷的關系的不一致性，可能與GSTM1、GSTT1基因型分布存在人群及種族的差異或抗結核藥物肝損傷與多基因共同作用或基因與環境共同作用有關。本研究雖未發現它們與抗結核藥物性肝損傷的直接關系，但發現GSTM1缺失基因型發生抗結核藥物性肝損傷的風險偏高，是否存在關聯，將進一步擴大樣本量加以證實。

本研究首次對NAT2基因多態性與GSTM1基因多態性聯合作用與抗結核藥物性肝損傷的關系進行研究，發現與單純具有NAT2慢乙酰化基因型(OR=4.74,P<0.05)、GSTM1缺失基因型(OR=1.64，P>0.05)患者相比，同時具有NAT2慢乙酰化基因型及GSTM1缺失基因型患者發生抗結核藥物肝損傷OR值高達10.21(P<0.05)，差異有統計學意義。

總之，NAT2乙?；蛐团c抗結核藥物性肝損傷密切相關，而慢乙?；蛐突颊吒装l生抗結核藥物性肝損傷。同時具有NAT2慢乙酰化基因型與GSTM1缺失基因型的患者發生抗結核藥物肝損傷的風險增高。通過對NAT2及GSTM1基因的進一步研究，有望深入了解抗結核藥物性肝損傷的發生機制、建立抗結核藥物致肝損傷易感基因型的分子生物學檢測方法，以指導臨床抗結核藥物和保肝藥物的應用。這對于減少肝損傷的發生、控制結核病疫情具有重要意義。

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