骨關節結核各類標本進行結核分枝桿菌培養與PCR檢測的陽性率結果分析

董偉杰 秦世炳 趙立平 付育紅 黃海榮

骨關節結核是除結核性胸膜炎和淋巴結核外最常見的肺外結核，約占結核病患者的1%～3%[1]。臨床上骨關節結核的診斷是一個難點，患者從首次出現癥狀到最后確診往往需要幾個月甚至幾年的時間。近年來，隨著磁共振成像(MRI)技術[2]的推廣使用，使得骨關節結核診斷所需時間大大縮短。雖然結核病的細菌學診斷是最直接可靠的證據，然而骨關節結核卻往往由于標本的不易獲得和培養陽性率低等原因，在骨關節結核的診斷中沒能發揮重要作用。為了解標本的性質和培養方法對培養陽性率的影響，筆者觀察了骨關節結核病灶中膿液、肉芽、死骨及干酪壞死組織的BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)培養及改良羅氏培養的培養陽性率，以期為將來骨關節結核標本的留取和培養方式的選擇提供依據，提高骨關節結核的細菌學診斷水平。

對象和方法

一、研究對象

選取2011年6月至2012年5月北京胸科醫院收治的術前通過CT及MRI發現存在膿腫及死骨，后經病理檢查明確診斷為骨關節結核的全部患者50例，其中男26例，女24例；年齡范圍為15～84歲，平均(40.7±19.6)歲；60歲以上老年患者9例(18.0%)；根據患病部位分為脊柱結核40例，關節結核8例，胸骨關節結核2例。所有患者均接受病灶清除手術，術中取得病灶中的膿液、干酪、肉芽及死骨組織，分別進行結核分枝桿菌MGIT 960 培養及改良羅氏培養，另外對所有的膿液標本開展了結核分枝桿菌PCR檢測。本研究標本為常規送檢標本中的剩余標本，已通過北京結核病胸部腫瘤研究所倫理委員會審核。

50例患者通過病灶清除術共分離出膿液標本50份、干酪標本42份、肉芽標本48份及死骨組織標本43份，其中有37位患者同時獲取了全部4種類型的標本。

二、實驗方法

1.標本處理：膿液標本依照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[3]中的N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-氫氧化鈉法進行標本處理。干酪、肉芽及死骨組織在加入適量磷酸鹽緩沖液后，應用微型研磨器Fastprep-24(美國MP Biomeidcals公司)進行勻漿，之后直接接種。

2.羅氏培養：接種后的改良羅氏培養基置于37 ℃培養，每周檢查一次細菌的生長狀態直至有菌落生長為止。以結核分枝桿菌標準株H37Rv作為陽性對照，以空白管作為陰性對照。

3. MGIT 960培養：接種后的MGIT 960培養管放入MGIT 960全自動細菌培養系統(美國BD公司)中進行培養，以結核分枝桿菌標準株H37Rv作為陽性對照，以空白管作為陰性對照。

4.結核分枝桿菌PCR檢測：采用達安基因公司生產的結核分枝桿菌PCR檢測試劑盒，陽性對照、陰性對照設置及其他具體操作見產品說明。

三、統計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計數資料采用百分率表示。

結 果

所有標本的改良羅氏培養結果，MGIT 960培養結果及PCR檢測結果見表1。依據MGIT 960培養陽性率排列4種標本順序為：死骨組織(41.9%，18/43)>膿液(40.0%，20/50)>肉芽(33.3%，16/48)=干酪(33.3%，14/42)；依據羅氏培養陽性率排列4種標本順序為：肉芽(20.8%，10/48)>膿液(20.0%，10/50)>死骨組織(16.3%，7/43)>干酪(14.3%，6/42)。以50例患者所取的4種標本中1種標本或以上培養陽性評價兩種培養方法，則MGIT 960 培養陽性率為42.0%(21/50)，羅氏培養陽性率為30.0%(15/50)；兩種培養方法的聯合陽性率為 50.0%(25/50)。

50份膿液標本單獨進行了PCR檢測，其中有24份PCR檢測陽性，陽性率為48.0%(24/50)。24份PCR檢測陽性的膿液標本中有18份培養也獲得陽性結果，另有6份標本培養陰性。PCR檢測、MGIT 960及改良羅氏培養3種方法的聯合陽性率為68.0%(34/50)。

表1 膿液、干酪、肉芽及死骨組織的MGIT 960、羅氏培養及PCR陽性情況

討 論

骨關節結核的診斷目前可以依賴的手段包括影像學檢測、病理學檢測和病原微生物學檢測。由于長期以來骨關節結核患者的結核分枝桿菌培養陽性率較低[4]，臨床上主要依賴影像學檢查進行診斷，依靠術后病理檢查進行最后確診，而作為結核病診斷最為直接可靠的細菌學檢查技術常得不到臨床醫生的重視。為了探討如何提高骨關節結核患者獲得細菌學診斷的比例，筆者開展了此項研究。

本研究發現，通過選取骨關節結核病灶中的膿液、肉芽組織、死骨及干酪壞死組織等多種標本，聯合使用BACTEC MGIT 960培養和改良羅氏培養可以獲得50.0%的培養陽性率。這一陽性率遠高于吳啟秋等[5]報道的應用BACTEC TB460檢測儀選取膿液、干酪壞死組織及肉芽組織進行培養獲得的18.4%的培養陽性率。進一步分析發現，除了增加羅氏培養小幅度提升了培養陽性率外，標本的處理方式對于陽性率提高有非常重要的作用。本研究中分離到的死骨組織的MGIT 960培養陽性率高于膿液及肉芽組織，這一結果出乎試驗設計之初的預期。本試驗中，筆者將死骨組織經微型研磨器打碎離心處理后進行常規培養，獲得的MGIT 960培養陽性率為41.9%(18/43)，高于骨關節結核患者最常留取的膿液標本的培養陽性率(40.0%，20/40)。由此表明，未來臨床醫生在骨關節結核手術中，應該盡量留取多種標本并根據標本選取恰當的標本處理方式，以提高后續培養的陽性率。

本研究中，4種類型標本MGIT 960培養的陽性率都較相應的羅氏培養陽性率高，提高程度從12.5%到25.6%不等，表明MGIT 960培養比羅氏培養更適用于骨關節結核患者的標本培養。然而對于所納入的50例患者，有4例患者僅羅氏培養獲得陽性結果，由此表明在條件允許的時候同時開展兩種培養有利于提高總體陽性率。對所有的膿液標本進行PCR檢測，再聯合改良羅氏培養及MGIT 960培養可使本組標本的總體陽性率達到68.0%。這從一個側面提示，骨關節結核病灶中的病變組織若得以妥善分離利用，并綜合利用目前成熟的微生物學培養方法及分子生物學技術將對骨關節結核的診斷大有裨益，對縮短診斷時間亦有積極意義。目前，對于早期骨關節結核的診斷，通常采用病變部位穿刺的辦法獲得標本，但在脊柱結核，由于解剖位置深，往往獲得的組織量微小[6]，除常規送檢病理外，如何通過分子生物學技術對穿刺標本進行處理，以獲得微生物學診斷依據，亦不失為日后努力的方向。

骨關節結核獲得細菌學證據不僅有利于確診，而且還為后續的細菌學研究提供了條件。以本研究為例，筆者對10株羅氏培養陽性的菌株開展了后續的藥敏試驗，其中5株被確定為耐藥菌株，而其中又有3株為耐多藥菌株。鑒于骨關節結核患者在手術之后仍然需要進行抗結核化療，而早期獲得患者耐藥及藥敏結果，并給予合理的抗結核治療并結合合理的手術方法是治愈的關鍵[7]，因此獲得藥敏試驗結果對于指導化療方案的選擇意義重大，而提高骨關節結核的陽性培養率是開展傳統藥敏試驗的前提。

傳統的培養和藥敏試驗有些耗時過長，影響了其對臨床的指導價值。新興的一些分子生物學技術如GeneXpert[8-9]尤以其能夠進行快速藥敏診斷而深受臨床歡迎。本研究至少提示未來開展新的分子診斷技術時，可以恰當地選擇術中取得的組織來進行有效檢測，以早期獲得藥敏試驗結果，以便及時發現耐藥患者，調整治療方案，以減少術后并發癥的發生。

總之，本研究的結果表明，對于骨關節結核患者，除了留取常規的膿液標本外，應盡可能選擇多種標本以提高培養陽性率。MGIT 960培養可以作為首選的細菌學診斷方法，但如果再聯合使用改良羅氏培養和PCR擴增技術，能夠進一步提高檢出陽性率。

[1] Caws M, Thwaites G, Dunstan S, et al.The influence of host and bacterial genotype on the development of disseminated di-sease withMycobacteriumtuberculosis. PLoS Pathog, 2008，4(3):e1000034.

[2] Pursey J, Stewart S. Potts disease: diagnosis with magnetic resonance imaging. Radiography, 2010,16(1): 84-88.

[3] 中國防癆協會基礎專業委員會. 結核病診斷實驗室檢驗規程.北京：中國教育文化出版社，2006.

[4] 趙雁林，尚美.我國結核病實驗室診斷的現狀.中華檢驗醫學雜志，2007,30(7)：725-728.

[5] 吳啟秋，潘毓萱，畢志強，等. 骨關節結核病灶中耐多藥結核分枝桿菌對療效的影響. 中華骨科雜志,2005,25(7): 431-433.

[6] 大會學術委員會. 骨關節結核診療共識(討論稿).結核病與肺部健康雜志，2012，1(3)：206-212.

[7] 秦世炳，董偉杰，蘭汀隆，等.128例脊柱結核耐藥患者的臨床分析.中國防癆雜志,2013,35(5)：299-304.

[8] Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, et al.Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N Engl J Med,363(11):1005-1015.

[9] 張治國，歐喜超，孫倩，等. 利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術檢測痰標本中結核分枝桿菌及其耐藥性的研究. 中國防癆雜志, 2013,35(1):13-16.