負載絲裂霉素C的明膠多孔支架制備及釋放*

朱繼翔，陳曉明，彭曄，陽范文，田秀梅，何福坡

(廣州醫科大學基礎學院生物醫學工程系，廣東廣州510182)

明膠是一種生物相容性良好的天然高分子材料，廣泛應用于組織工程支架的制備［1－3］。它含有類似于精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸(RGD)的序列，能夠促進細胞的粘附與生長。然而，生物機體中的許多組織受損后，在修復和愈合過程中，會產生不同程度的瘢痕組織，它在一定程度上保護了受損組織，但是，瘢痕組織的過度生長會帶來不良影響。比如，中樞神經受損后，膠質瘢痕產生，阻礙脊髓中再生神經形成通路，導致癱瘓［4］;而在包括尿道重建等泌尿系統疾病的臨床治療以及術后恢復過程中，往往會出現瘢痕引起的泌尿系統狹窄［5］。因此，利用組織工程支架進行組織再生修復時，不僅需要促進細胞在支架中的生長與遷移，而且需要抑制支架中瘢痕細胞與組織的過度增生。

絲裂霉素C(MMC)是一種廣譜抗腫瘤抗生素，它提取自頭撞鏈霉菌產生的抗生素混合物，可以破壞細胞DNA的結構與功能，抑制增殖期DNA的復制以及RNA的合成，從而有效抑制細胞的過度增殖［6］。目前，MMC已經應用于臨床，如在膀胱癌療中，減少術后腫瘤細胞的增生［7］;在青光眼手術治療中，減少術后濾過泡的瘢痕化，提高手術成功率［8］。近年來，以生物可吸收類聚酯為載體的載藥微球研究備受關注，它可以維持藥物穩定性，延長藥物緩釋時間，降低藥物毒副作用，為藥物的負載與緩釋提供了重要參考。

本研究采用生物可吸收類聚酯PLGA微球作為載體，制備負載MMC的PLGA微球。利用冷凍干燥法制備含有載藥微球的明膠多孔支架，并對其性能及藥物緩釋進行研究。

1 實驗部分

1.1 主要試劑和原料

明膠(180g Bloom)，聚乙烯醇(PVA)，Sigma;PLGA，分子量5萬，惠州華陽醫療器械有限公司;絲裂霉素C，京尼平，上海阿拉丁試劑。

1.2 PLGA/MMC微球的制備

稱取200mg的PLGA與20mg的MMC溶解于8mL二氯甲烷與2mL丙酮的混合溶劑中。將上述溶液緩慢注入100mL的PVA水溶液(2%，w/v)，乳化10分鐘后，倒入1L蒸餾水中，溶劑揮發12小時。離心分離所得微球，蒸餾水清洗3次，除去微球表面殘留的PVA，冷凍干燥3天，于干燥器中存儲備用。

1.3 明膠多孔支架的制備

稱取800mg的明膠，溶解于10mL超純水中后，加入200mg的PLGA/MMC微球;然后，加入100mg的京尼平粉末，攪拌均勻，交聯24小時。－20℃預凍1小時，冷凍干燥3天，室溫下，于干燥器中保存。測量支架的孔隙率、溶脹率與壓縮模量［9］。

1.4 明膠多孔支架中MMC的體外釋放

稱取50mg明膠多孔支架裝入10mL磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)的試管中;37℃，45r/min恒溫振蕩器中釋放;間隔一段時間取出2mL釋放液樣本，同時補充2mL新鮮磷酸鹽緩沖溶液;測定358nm處紫外吸收，并結合MMC標準曲線計算釋放液中MMC的含量。時間間隔為:3天，1周，2周，3周，4周，5周。

2 結果與討論

2.1 微球與支架的微觀形貌

通過掃描電鏡觀察載藥微球的微觀形貌，結果如圖1(a)所示。PLGA/MMC微球表面光滑，微觀呈規整的球狀，粒徑大約為35 μm，分布較均勻。微球的粒徑大小、載藥量以及成球率等性能受到眾多制備參數的影響［10］。一般情況下，乳化劑的濃度高，乳化效果好，微球粒徑小，分布也相對集中。但是，過高濃度的乳化劑影響微球的表面形貌與實際應用。載藥聚合物的濃度對微球的制備效果影響也較大，如果聚合物濃度過高，使得溶液粘度較大，在相同剪切力下，不易分散，成球效果不佳;如果聚合物濃度過低，微球在制備過程中容易出現塌陷現象。經過預實驗，我們優選乳化劑濃度為2%，聚合物濃度為20mg/mL。另外，油相溶劑的選擇也影響微球的制備，在二氯甲烷中加入適量的丙酮，一方面增加了MMC在油相中的溶解度，另一方面，也達到了改善微球形貌的目的。利用冷凍干燥法制備明膠支架，在制備過程中加入載藥微球，所得支架的微觀形貌如圖1(b)所示。支架的微觀呈多孔結構，微孔之間的連通性較高，平均孔徑約為150 μm。支架的孔壁中，嵌入了PLGA/MMC微球，載藥微球分布相對較均勻。

圖1 (a)負載MMC的聚合物微球及(b)含有載藥微球的明膠支架Fig.1 SEM picture of(a)PLGA/MMC microsphere and(b)gelatin scaffold with microsphere

2.2 明膠支架的性能

對比含有載藥微球的明膠支架的性能與相同條件下制備得到的未含載藥微球明膠支架的性能，結果如表1所示。兩者在孔隙率、溶脹率以及壓縮模量參數上性能相似?？梢姡诿髂z多孔支架內部植入載藥微球，并不會較大地改變支架本身的相關性能。含有載藥微球的明膠多孔支架，孔隙率達到90.2%;對支架進行化學交聯，使得支架的溶脹率維持在20%左右，在生理環境下，支架的結構穩定。明膠微球支架的壓縮模量為52.1kPa，可以保證支架具有一定的力學強度與彈性，在組織修復過程中，承受來自周圍組織的壓迫，以及機體運動產生的張力，保持支架結構的完整，為組織再生與修復提供有利條件。

2.3 體外釋放研究

模擬體內環境，對PLGA/MMC載藥微球與明膠微球支架的藥物緩釋行為進行研究，結果如圖2所示。體外釋放實驗結果表明，載藥微球在釋放初期無明顯暴釋現象，微球累計釋放藥物5周，累積釋放量達到77.3%。釋放過程大致可分為三個階段，第1周內，微球的釋藥速率相對較快，累計釋放量為44.7%;在第2周至第4周內，釋藥速率均勻，達到穩定;第5周時，釋藥速率較緩慢，整個釋放體系達到平衡狀態。支架中MMC的釋放相對純載藥微球組有一段時間的延遲，5周累積釋放MMC為65.2%。在釋放開始的1周內，僅有少量的藥物釋放，累計釋放量僅為12.2%;在第1周至第3周內，釋藥速率有所增加，平均每周約釋放17.2%的MMC;在第3周至第5周內，釋藥速率均勻，達到平衡。支架中MMC的釋放受微球性能與支架性能的共同影響。少量的MMC可以通過擴散作用，經過微球壁與支架管壁，釋放到周圍體系中，而多數MMC的釋放需要經歷支架與微球結構的降解。因此，支架中MMC的釋放趨勢相對載藥微球有一定的延遲。載藥微球需要在支架結構發生一定程度的降解后，才能有效進行藥物緩釋。這一結果也表明，可以通過控制支架的降解時間，調控支架中藥物緩釋的發生時間，使得支架中的藥物在合適的時間點控制釋放。

圖2 微球與支架的累計釋放曲線Fig.2 The MMC cumulative release of microsphere and gelatin scaffold

3 結論

(1)采用單乳化溶劑揮發法制備負載MMC的PLGA微球，通過相分離與冷凍干燥，制備含有載藥微球的明膠多孔支架。支架的孔隙率達到90.2%，溶脹率為22.7%，壓縮模量為52.1kPa。

(2)體外釋放實驗表明，載藥微球中，MMC在5周的累計釋放量為77.3%;支架中MMC的釋放相對較緩，5周累積釋放量為65.2%。這種含有載藥微球的明膠多孔支架具有潛在的抗瘢痕應用前景。

［1］Nakamura S，Kubo T，Ijima H.Heparin-conjugated gelatin as a growth factor immobilization scaffold［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2013，115(5):562－567.

［2］Jaiswal A K，Chhabra H，Soni V P，et al.Enhanced mechanical strength and biocompatibility of electrospun polycaprolactone-gelatin scaffold with surface deposited nano-hydroxyapatite［J］.Materials Science and Engineering:C，2013，33(4):2376－2385.

［3］張恒，紀秀麗.可生物降解納米膠囊的囊材、化學制備和表征［J］.合成材料老化與應用，2008，37(3):44－48.

［4］Liu R，Chen X P，Tao L Y.Regulation of axonal regeneration of following the central nervous system injury in adult mammalian［J］.Neurosci Bull，2008，24:396－400.

［5］Chapple C，Osman N，MacNeil S.Developing Tissue-Engineered Solutions for the Treatment of Extensive Urethral Strictures［J］.European Urology，2013，63:539－541.

［6］Paul A H，Margaret A B，Johannes R.DNA adduct formation of mitomycin C［J］.Computational and Theoretical Chemistry，2013，1055:9－1.

［7］Hamid M，Iraj M，Fatemeh G.Effect of Mitomycin C on Anterior Urethral Stricture Recurrence after Internal Urethrotomy［J］.European Urology，2007，51:1089－1092.

［8］Miguel A T，Laura B L，Jorge L A.Mitomycin C in Corneal Refractive Surgery［J］.Survey of Ophthalmology，2009，54(4):487－502.

［9］Zhu J X，Xiong Y，Zeng C G，et al.Elastic chitosan conduits with multiple channels and well defined microstructure［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2012，51:105－112.

［10］Han B，Wang H T，Liu H Y，et al.Preparation of pingyangmycin PLGA microspheres and related in vitro/in vivo studies［J］.International Journal of Pharmaceutics，2010，398:130－136.