BMSCs在骨關節(jié)外科領域中的研究進展

孫鵬浩,王宸,常青

(東南大學附屬中大醫(yī)院，江蘇 南京 210009)

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal-stem cells，BMSCs)是干細胞的一種，存在于骨髓中，它的存在是1976年由Friedenstein等[1]首次提出的。因為其在體外培養(yǎng)過程中容易貼壁并形成纖維樣的克隆，因此也被稱為成纖維細胞集落形成單位。多數的BMSCs在體內處于休眠狀態(tài)，只有當受到一定刺激因素作用時才進入細胞周期，增殖并分化成骨或軟骨組織等之類的細胞集落。

1 BMSCs的分離培養(yǎng)

目前，體外分離培養(yǎng)BMSCs較為常用的方法有：(1) 全骨髓培養(yǎng)法：因BMSCs體外培養(yǎng)時有貼壁生長的特性，故在無菌獲得的骨髓中加入培養(yǎng)基制成細胞懸液，將細胞懸液直接置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，原代培養(yǎng)時培養(yǎng)物中造血細胞占大多數。該方法的優(yōu)點在于操作簡單、細胞活性好，但所得細胞的雜質細胞較多，純度不高[2- 3]；(2) 離心培養(yǎng)法：利用骨髓中各種細胞比重的不同，使用梯度離心法分離并提取BMSCsS后進行培養(yǎng)。在骨髓中加入淋巴細胞分離液稀釋混勻后，以1 500～2 000 r·min-1的速度離心20～30 min，取交界處的單核細胞層，再用PBS沖洗2～3次，加入培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)即可。這種方法優(yōu)點為所獲得細胞純度較高，但因為淋巴細胞分離液有一定的細胞毒性，且整個過程中進行了數次的離心，故而使細胞的活力降低[2,4]；(3) 細胞表面分子標記分選法：利用BMSCs的細胞表面標記物進行分離,這種方法一般利用流式細胞儀、免疫磁珠或者免疫沉積法。盡管通過此方法獲得的細胞純度很高，但由于如今研究仍未找到特異性的BMSCs表面標記物，而且該方法步驟較多、過程長、成本較高、分選效率低，且對細胞活性有明顯影響，故較少采用[2,5]。

2 BMSCs的生物學特性

2.1 形態(tài)學特征

BMSCs體外培養(yǎng)時細胞形態(tài)主要表現(xiàn)為梭形、紡錘形，少數BMSCs為多角形。由于BMSCs細胞貼壁生長的特性，體外培養(yǎng)時其可以貼附于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶表面，并形成集落或融合層。原代細胞接種后約1 d就可見細胞貼壁生長，剛貼壁的細胞多為單個，形態(tài)多為圓形，首次換液后5～7 d可見集落形成，細胞形態(tài)呈長梭形、三角形或星形。原代細胞通常培養(yǎng)10 d左右，可見細胞增殖迅速，兩周后每個小集落即可形成由數百至上千個細胞組成的大集落。

2.2 增殖擴增能力

由于骨髓中BMSCs的含量非常少，且數目隨著供體年齡的增長或身體情況的衰弱數量會逐漸減少，因此要獲得足量的BMSCs必須在體外進行大量擴增。而BMSCs增殖擴增能力較強，故體外培養(yǎng)條件下可以滿足大量擴增的需要。2000年Colter等[6]研究表明，BMSCs在低密度條件下培養(yǎng)仍能保持增殖能力。1999年Conget等[7]發(fā)現(xiàn)人體內約20%的BMSCs處于靜止狀態(tài)，盡管如此，體內的BMSCs仍能滿足增殖分化的需求。將BMSCs以7 000 cm-2的密度接種，4 d后P1代擴增2.4倍，傳至第20～25代時BMSCs在細胞形態(tài)、生長速率及免疫表型等方面無明顯改變，同時每個BMSCs此時大約擴增為5.5×108個細胞。

2.3 表面標記

目前研究表明，BMSCs可以表達許多種細胞表面標記物，如內皮細胞、間質細胞及表皮細胞等的表面標記物。目前已知的BMSCs表達的表面標記物有CD166、CD106、CD102、CD54、CD44、 IL- 1R 、IL- 3R、IL- 4R、IL- 6R、IL- 7R、 IFN- CR、TNF- A、CD49a、CD49b、CD49c、CD104、CD29等。但BMSCs并不表達造血細胞類的表面標記物，如CD3、CD4、CD8、CD14、CD31、CD34、CD45、CD117等，也不表達HLA- DR等。目前，關于BMSCs特異性的表面標記物的結論尚不一致，暫時仍沒有標準的表面標記物[8- 11]。

2.4 免疫調節(jié)

一般組織器官或細胞移植術后受體可識別移植物抗原發(fā)生免疫應答使得移植物的破壞，從而喪失原有功能。但目前大量相關試驗發(fā)現(xiàn)，BMSCs用于體內治療時很少出現(xiàn)此類免疫排斥反應。對于BMSCs如何進行免疫調節(jié)，目前研究主要傾向以下說法[12]。

2.4.1 低免疫原性 BMSCs由于缺少T淋巴細胞活化所需的第1、2信號傳導系統(tǒng)，因此無法表達共刺激分子B71、B72、HLA- Ⅱ類分子及FASL，也不表達CD40和CD41，所以不能誘導T淋巴細胞的增殖。BMSCs分化成各種細胞后始終不表達HLA- Ⅱ類分子，因此也不發(fā)生免疫應答。

2.4.2 對免疫細胞的作用 (1) 對T細胞的抑制：Krampera等[13]實驗發(fā)現(xiàn)BMSCs可以抑制特異性的記憶T細胞與幼稚型T細胞的增殖，但不能抑制抗原反應性T細胞。相關實驗證明，BMSCs可分泌IL- 2、IL- 6、IL- 7、IL- 8、IL- 10、IL- 11～15、IFN-γ、TNF-α、TGF-β等細胞因子[14]，而其中的IFN-γ、IL- 10、TNF-α、TGF-β和IL- 2可抑制T細胞增殖；(2) 對B細胞的抑制：BMSCs可通過抑制B細胞的增殖、活化及IgG的分泌，從而起到對B細胞的調節(jié)作用[15- 16]。(3) 對抗原遞呈細胞的作用：在抗原的遞呈、T細胞增殖的誘導及B細胞向漿細胞轉化的過程中，樹突狀細胞(DC)，且只有成熟的DC發(fā)揮著重要的作用。另外，BMSCs可以通過抑制MHC- Ⅱ及T細胞共刺激因子的表達而抑制DC的成熟，最終抑制T細胞的增殖和活性。

2.5 多分化潛能

BMSCs具有多向分化的潛能，在不同的誘導條件下BMSCs可以分化為不同譜系的細胞，如成骨細胞、肌肉細胞、神經細胞等[17],其中BMSCs向成骨細胞、軟骨細胞、肌腱細胞誘導分化的研究及應用在骨關節(jié)領域有著重要的意義。

3 BMSCs的分化機制及影響因素

BMSCs向不同譜系細胞的分化過程受到諸多因素的影響，在不同刺激因素的作用下，BMSCs的分化種類有有著很大的區(qū)別。

3.1 成骨細胞分化

Friedenstein等于1976年時實驗發(fā)現(xiàn)，BMSCs在體外經過數代培養(yǎng)后，部分BMSCs可分化成類似骨或軟骨組織的沉積物[18]。1999年時Pittenger等[19]在培養(yǎng)基中加入地塞米松、抗壞血酸及β- 磷酸甘油等，并用培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)BMSCs，發(fā)現(xiàn)BMSCs可分化為成骨細胞。后來，Ouyang等[20]利用加有抗壞血酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs，然后將其置入受損部位，3周后觀察顯示植入物的結構與正常骨膜相似，且BMSCs向成骨、軟骨分化。目前研究發(fā)現(xiàn)，調節(jié)BMSCs成骨分化的因素很多，研究較多的有地塞米松、轉化生長因子、維生素C、D3。實驗證明，地塞米松可以促進成骨細胞的分化成熟，同時提高堿性磷酸酶活性[21- 22]。同時，地塞米松可以促進BMSCs的礦化作用。除地塞米松以外，研究表明適宜濃度的轉化生長因子β1(TGF-β1)也能有效促進BMSCs的成骨分化，目前TGF-β1也是誘導BMScs分化的首選生長因子之一，其在BMSCs的細胞生長、成骨分化、骨基質合成和骨重建等過程中起著不可或缺的調控作用。另外，骨形成蛋白也是轉化生長因子β超家族成員的一員，不過體外骨形成蛋白的作用存在種特異性，其可以促進大鼠和小鼠的成骨分化，但骨形成蛋白2不能誘導人BMSCs的成骨分化。

3.2 成軟骨細胞分化

實驗證明，利用加入TGF-β、BMP及整合素的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs，BMSCs可向軟骨細胞分化。在體外培養(yǎng)情況下，BMSCs能分泌軟骨細胞特征性細胞外基質，如Ⅱ型膠原、氨基多糖等，這進一步為BMSCs作為軟骨組織工程的種子細胞來源提供可能性。除了TGF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)可以參與調控BMSCs成軟骨分化外，還有如地塞米松、維生素C、FGF等，其中地塞米松、TGF-β以及維生素C在其過程中起著重要作用。地塞米松可以增強相關基因的表達，提高軟骨細胞外基質標記分子的蛋白質水平，尤其是Ⅱ型膠原的水平。維生素C本身不能誘導BMSCs成軟骨分化，卻可以通過調節(jié)細胞外基質的組成與排列促進細胞的自分泌與旁分泌作用，從而使細胞增殖與轉化。轉化生長因子(如TGF-β1、β2、β3等)能夠促進細胞的增殖、分化，同時可促進細胞外基質的合成分泌。另外，BMP具有誘導BMSCs成軟骨分化的能力。實驗證明，TGF-β1與BMP2聯(lián)合時可以更有效地促進BMSCs向軟骨細胞分化[23]。

3.3 肌腱細胞分化

實驗證明BMSCs具有向肌腱細胞增殖分化的潛能，而BMSCs向肌腱細胞的分化過程離不開多種細胞生長因子的共同參與、生物力學環(huán)境的影響等綜合因素。參與BMSCs成肌腱分化過程的細胞因子很多，目前已知的有堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子- 1(IGF- 1)、轉化生長因子- D、骨形態(tài)發(fā)生蛋白12(BMPl2)等。bFGF是一種重要的有絲分裂因子，它可以刺激血管形成，加快細胞的分化增殖并抑制凋亡。IGF- 1可以加快mRNA的轉錄及蛋白的合成，促進細胞增殖。bFGF和IGF- 1不僅具有促進成纖維細胞增殖和膠原分泌的能力，也具有促進間充質干細胞向肌腱細胞分化的能力[23- 24]。

BMSCs在向不同譜系分化的過程中，除了生長因子還受著諸多影響因素的影響和調控，如培養(yǎng)方法、微環(huán)境、支架材料及基因等等，其中微環(huán)境包括BMSCs細胞培養(yǎng)過程中的物理因素、共培養(yǎng)、生物反應器等。研究證明，體外培養(yǎng)時低氧條件下BMSCs向軟骨細胞分化的能力更強。關節(jié)軟骨所在的關節(jié)腔是一種低氧的環(huán)境，在體外低氧環(huán)境下誘導培養(yǎng)的BMSCs向軟骨細胞分化，與這種低氧環(huán)境模擬了關節(jié)腔的生理環(huán)境可能有一定的關系[25]。也有一些研究結果顯示適當的力學因素刺激對于BMSCs的分化，尤其是成軟骨分化方面有一定的積極作用[26]。Mouw等[27]發(fā)現(xiàn)一定的力學刺激可以促進TGF-β1的表達，而TGF-β1可以提高BMSCs對力學刺激的敏感性。隨著組織工程技術的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)良好的支架材料不僅有利于細胞貼附生長，還可以誘導BMSCs的分化過程[27- 29]。許多實驗也證明，共培養(yǎng)可以刺激BMSCs的分化增殖，有人將馬的BMSCs與軟骨細胞以1∶1的比例混合在體外進行細胞團塊的培養(yǎng)，結果共培養(yǎng)組的Ⅱ型膠原、蛋白多糖以及SOX9基因的表達高于軟骨細胞對照組。其機理可能與共培養(yǎng)細胞分泌多種細胞因子和特異性細胞外基質，以及共培養(yǎng)細胞與BMSCs間的信號傳導通路等因素有關。

4 BMSCs在骨外科的應用

基于BMSCs強大的分化潛能及易于分離培養(yǎng)、遺傳相對穩(wěn)定等特性，BMSCs成為組織工程中理想的種子細胞之一，目前在組織工程、細胞治療等方面的應用日益廣泛，尤其在骨科領域也顯示出了其不同于傳統(tǒng)治療方式的優(yōu)越性。

4.1 骨缺損修復

隨著組織工程學技術的發(fā)展，組織工程學技術在臨床上的應用也為臨床疾病的治療提供新的方法。例如治療骨缺損時可以將BMSCs與支架材料組成的復合物移植到骨缺損部位，從而起到良好的治療作用。Borden等[30]在多聚微球基質材料中加入BMP- 7及BMSCs并植入大段的骨缺損動物模型中，結果發(fā)現(xiàn)其可以誘導新骨的長入，且增強BMSCs的成骨活性。Quarto等[31]將BMSCs與羥基磷灰石構建的組織工程骨植入動物長骨缺損處，結果表明實驗組均可完全恢復患肢肢體的功能。大量實驗結果表明，將BMSCs與支架材料形成的復合物或組織工程軟骨植入體內骨缺損區(qū)域后，可直接增強病損局部細胞介導的骨再生能力，快速修復大段骨缺損。目前利用骨組織工程技術，BMSCs在治療骨缺損等疾病方面為今后臨床治療骨缺損提供了一種新的、有效的可能。

4.2 軟骨修復

關節(jié)軟骨由于缺乏血供且軟骨細胞自我增殖能力極弱，因此關節(jié)軟骨損傷時很難自愈，這也是臨床上關節(jié)軟骨損傷治療的一重大難題。Wakitani等[32]首次將體外純化培養(yǎng)的自體BMSCs復合Ⅰ型膠原凝膠植入兔膝關節(jié)軟骨缺損區(qū)域，2周后病灶處即形成透明軟骨，24周后關節(jié)軟骨缺損處得以修復，不過與正常關節(jié)軟骨相比修復后的軟骨更薄，且部分區(qū)域缺乏軟骨細胞分泌的蛋白多糖。Yoo等[33]將體外培養(yǎng)的BMSCs導入修飾基因，并將其與軟骨誘導因子一起注入軟骨損傷區(qū)域，結果發(fā)現(xiàn)受損的關節(jié)軟骨逐漸得到恢復。隨著組織工程技術的發(fā)展，人們將BMSCs嵌入支架材料后植入缺損部位，利用支架直接為細胞提供所需的生長因子而獲得透明軟骨，修復軟骨損傷，且修復的軟骨與周圍組織連接良好[34]。

4.3 肌腱損傷修復

與關節(jié)軟骨類似，肌腱組織也缺乏血供且修復能力弱，因而肌腱的治療也是臨床一大難題。有人將復合了BMSCs的膠原纖維移植到損傷的肌腱處，發(fā)現(xiàn)其可以促進肌腱的修復。已有研究表明，相比于無BMSCs的膠原纖維，復合有BMSCs的膠原纖維修復后的肌腱更粗、膠原纖維束更加成熟，且生物力學性能也更為優(yōu)越。

5 展 望

隨著組織工程學技術的日益發(fā)展，人們對于BMSCs的研究已取得了很大的進步，但目前對于BMSCs的研究僅僅剛開始而已，仍有許多難題需要我們進一步的研究，如:(1) 進一步明確BMSCs特異性的表面標記物，建立明確標準,這需要我們對BMSCs分化各階段的細胞表面標志物進行進一步研究。(2) 找到更加理想的支架材料。(3) 轉基因技術的完善，從而發(fā)揮轉染后靶細胞的更大生物學效應[35]。

[1] FRIEDENSTEIN A J，GORSKAJA U，KULAGINA N N.Fiberoblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs[J].Exp Hematol，1976，4(5):267- 274.

[2] 潘欣宇，崔穎，馬林祥.骨髓間充質干細胞的研究進展及臨床應用前景[J].中國醫(yī)學工程,2011,19(5):173- 176.

[3] 張衛(wèi)東，史宏燦，章方彪.兔骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)方法的比較[J].中華實驗外科雜志,2013,30(7):1360- 1363.

[4] 楊玉霞,鄭健樑,張平.密度梯度離心結合貼壁法培養(yǎng)成年大鼠骨髓間充質干細胞的生物學特性[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(3):583- 586.

[5] 張蓉，沈開金，劉彥普.兔骨髓間充質干細胞的體外培養(yǎng)及多向誘導分化[J].中國組織工程研究與臨床康復,2010,14(45):8382- 8385.

[6] COLTER D C，CLASS R，DIGIROLAMO C M，et al.Rapidexpan of recycling stemcells in cultures of plsstic adherent cells from human bone marrow[J].Proc Nat Acid Sci USA，2000，97(7):3213- 3218.

[7] CONGET P A，MINGUELL J J.Phenotypicaland functional properties of human bonemarrow mesenchymal progenitor cells[J].J Cell Physiol，1999，181(1):67- 73.

[8] 劉劍偉，肖增明.骨髓間充質干細胞在骨科組織工程中的應用[J].中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(46):9375- 9378.

[9] 郭峰，張翠.骨髓間充質干細胞的研究進展[J].疑難病雜志,2010,9(5):393- 394.

[10] 王慶賢，張英澤，馬哲，等.骨髓間充質干細胞研究進展[J].中華實驗外科雜志,2003,20(6):575- 576.

[11] 邱林，金先慶.骨髓間充質干細胞的生物學特性及其臨床治療應用[J].中國組織工程研究與臨床康復,2008,12(12):2347- 2350.

[12] 潘欣宇，崔穎，馬林祥，et al.骨髓間充質干細胞的研究進展及臨床應用前景[J].中國醫(yī)學工程，2011,19(5):173- 176.

[13] KRAMPERA M，GLENNIE S，DYSON J，et al.Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen- specific T cells to their cognate peptide[J].Blood，2003，101(9):3722- 3729.

[14] GUO J，LIN G S.Anti- inflammation role for mesenchymal stem cells transplantation in myocardial infarction[J].Inflammation，2007，30(3- 4):97- 104.

[15] AGGARWAL S，PITTENGER M F.Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses[J].Blood，2005，105:1815- 1822.

[16] DENG W，HAN Q，LIAO L，et al.Effects of allogeneic bone marrowderived mesenchymal stem cells on T and B lymphocytes from BXSB mice[J].DNA Cell Biol，2005，24:458- 463.

[17] 傅文玉，路艷蒙，樸英杰.人骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)及多能性研究[J].中華血液學雜志,2002,23(4):202- 204.

[18] PROCKOP D J.Marrow stromal cell as stem eeUs for nonhematopoietie tissues[J].Science,1997,276(5309):71- 74.

[19] PITTENGER M F，MAEKAY A M，BECK S C，et a1.Multilineage potential adult human mesenchymal stem cells [J].Science,1999,284(54 11 1:143- 147.

[20] OUYANG H W,CAO T,ZOU X H.Mesenchymal stem cell sheets revitalize nonviable dense grafts:implications for repair of largebone and tendon defects[J].Transplantation 2006,82(2):170- 174.

[21] 吳軍，張燕燕.骨髓間充質干細胞生物學特性及臨床應用進展[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007，11(50):10134- 10137.

[22] 李彥林，韓睿，王?？?骨髓間充質干細胞在骨及軟骨組織工程中的應用[J].中國臨床康復,2006，10(5):121- 124.

[23] 艾自明，任慧霞，羅俊永.生長因子對骨髓間充質干細胞增殖、分化的影響[J].生命的化學,2010，30(1):33- 37.

[24] 倪明，王巖，李剛.骨髓間充質干細胞的成肌腱分化促進肌腱愈合的實驗研究[D].北京：軍醫(yī)進修學院，2011.

[25] 李寧.低氧微環(huán)境對間充質干細胞增殖、分化影響的研究進展[J].重慶醫(yī)學,2010,39(8):897- 898.

[26] 張永強，楊自權，衛(wèi)小春.骨髓間充質干細胞成軟骨分化的影響因素研究進展[J].中華實驗外科雜志,2011，28(7):1193- 1194.

[27] MOUW J K,CONNELLY J T,WILSON C G.Dynamic compression regulates the expression and synthesis of chondrneyte- specific matrix molecules in bone marrow strnmal[J].Cells,2007,25:655- 663.

[28] OVIC L D,VARGA I,ZAMBOREKY′ R，et al.The tissue engineering of articular cartilage:cells,scaffolds and stimulating factors[J].Exp Biol Med,2012,237:10- 17.

[29] 張韜，祝少博，喻愛喜.hTGF-β1基因修飾BMSCs復合藻酸鈣凝膠三維培養(yǎng)構建組織工程化軟骨[J].中華顯微外科雜志，2012,35(1):40- 45，97.

[30] BORDEN M，ATTAWIA M，KHAN Y，et al.Tissue- engineered bone formationinvivousing a novel sintered polymeric microsphere matrix[J].J Bone Joint Surg Br，2004，86(B):1200- 1208.

[31] QUARTO R，MASTROGIAEOMO M，CANEEDDA R，et al.Repair of large bone defects by autologous human bone marrow stromal cells[J].N EngI J Med，2001，344(5):385- 386.

[32] WAKITANI S,GOTO T,PINEDA S J.Mesenchymal cell- based repair of large, full thickness defects of articular cartilage[J]. J Bone Joint Surg Am,1994(4):579- 592.

[33] YOO J U，MANDEU L，ANGELE P，et al.Chondrogenitor cells and gene therapy[J].Clin Orthop，2000，379(suppl):64- 70.

[34] 譚洪波，楊柳.局部關節(jié)軟骨和骨軟骨損傷修復策略的研究進展[J].中華關節(jié)外科雜志,2012,4(6):795- 802.

[35] 崔鳳鳴，朱海濤，包善華,等.骨髓間充質干細胞作為胰腺癌基因治療載體的實驗研究[J].現(xiàn)代醫(yī)學,2011,39(4):387- 392.