A1蛋白與前列腺特異性抗原在前列腺癌與前列腺增生疾病中聯合檢測的意義

馬增煌

A1蛋白與前列腺特異性抗原在前列腺癌與前列腺增生疾病中聯合檢測的意義

馬增煌

目的選取50～70歲之間的前列腺增生、前列腺癌患者和健康對照者，對其血液中A1蛋白的表達與PSA的表達水平進行比較分析，為前列腺增生和前列腺癌的臨床鑒別診斷提供依據。方法采用電化學發光儀檢測PSA濃度，采用反轉錄酶?聚合酶鏈鎖反應（RT?PCR）技術和蛋白免疫印跡法（western?blot）檢測20例前列腺癌患者、20例前列腺增生患者和20例正常者新鮮前列腺組織中A1mRNA和蛋白的表達情況，探討A1蛋白表達與前列腺增生和前列腺癌中PSA表達水平的關系。結果RT?PCR與westem?blot檢測結果一致，A1蛋白在前列腺增生組織和前列腺癌組織中均有陽性表達，前列腺癌組織中A1蛋白陽性表達明顯高于前列腺增生組織，有顯著性差異（P＜0.01）。A1蛋白表達的陽性率與PSA的濃度相關。結論A1蛋白陽性表達程度與前列腺病變程度相關，A1蛋白在細胞凋亡調節中起著重要的作用，其過度表達在前列腺癌的發生、發展中扮演著重要的角色。聯合檢測A1和PSA的表達變化對判斷前列腺癌的生物學行為有參考價值。

前列腺癌；前列腺增生；前列腺特異性抗原；A1蛋白

由男性重要的性腺器官前列腺引起的疾病在不同的年齡階段有不同的特點，老年人則多為前列腺增生（benign prostate hyperplasia BPH）及前列腺癌（prostate cancer），隨著年齡的增加，前列腺癌的發病率呈明顯增加的趨勢，前列腺癌是男性泌尿生殖系最常見的腫瘤。應用前列腺特異抗原（prostatic specific antigen，PSA）進行大規模前列腺癌篩查，是目前早期診斷前列腺癌的最有效方法。但其對前列腺癌的早期診斷仍有一定困難和偏差，容易漏診。分子生物技術的發展已經證明前列腺癌的發生和發展是多種癌基因和抑癌基因共同作用的結果，我們可以從蛋白水平和基因水平檢測前列腺癌。本實驗通過檢測A1蛋白的表達水平和PSA的濃度，以探討A1蛋白和PSA與前列腺癌和前列腺增生的相關性。

1 資料與方法

1.1 標本來源 組織標本：收集黃石市中心醫院病理科2010～2013年前列腺標本，患者年齡50～70歲，平均患者（62.7±0.31）歲，前列腺癌組織標本（n＝20），前列腺增生組織標本（n＝20），正常組前列腺組織標本（n＝20），液氦保存。

血液標本：無抗凝的采血管采集肘靜脈全血4ml，室溫靜置1 h凝固，然后4℃，2000 r／min離心10min，取出上層血清，分裝于聚丙烯EP管中，－80℃冰箱保存待測。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養液、小牛血清購自Gibco公司；Trizol、引物購自Invitrogen公司；反轉錄酶?聚合酶鏈反應（RT?PCR）試劑盒購自TOYOBO公司；100 bp DNA Ladder購自天為時代；蛋白抽提試劑盒購自Pierce公司；丙烯酰胺、N，N′?甲叉雙丙稀酰胺、TEMED、Tris、SDS、過硫酸銨、甘氨酸購自Promega公司；PVDF膜，BSA，BLAST試劑盒購自Perkin Elemer公司；鼠抗人A1單克隆抗體購自日本MBL公司；羊抗鼠IgG／HRP購自美國Proteintech Group公司，內參anti?β?actin／HRP購自北京博奧森公司；化學發光試劑盒購自Roche公司。

1.3 PSA濃度的檢測 使用德國羅氏P800全自動生化分析儀檢測血清中的PSA濃度，采用電化學發光方法，標本均為同批測定，以上檢測均受控于衛生部臨檢中心、湖北省臨檢中心的室間質評。

1.4 細胞培養 以含10%胎牛血清的1640培養基，于37℃、5%CO2孵箱內培養，每2～3 d傳代1次。

1.5 A1 mRNA表達

1.5.1 引物設計：應用計算機軟件設計引物序列為：β2微球蛋白：正義鏈：5’?CTC ACG TCA TCC AGC AGA GA?3’，反義鏈：5’?CAA GCT TTG AGT GCA AGA GA?3’，目的擴增產物長度為629 bp；A1：正義鏈：5’?TACAGGCTGGCTCAGGACTAT?3’，反義鏈：5’?GATGCCGTCTTCAAACTCCTT?3’，目的擴增產物長度為222 bp。

1.5.2 RT?PCR cDNA的制備：在20μl反轉錄反應體系中進行反轉錄（1μl AMV反轉錄酶，0.5μl RNase抑制劑，Random primer 1μl，3μl底物混合物）。反應條件為：30℃10min；42℃20min；99℃5min；4℃5 min。PCR擴增：分別加2種引物在50μl PCR反應體系中進行同管擴增（94℃2 min，1個循環；94℃15 s；52℃30 s；72℃延伸30 s；30個循環）。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠，加入10μl擴增產物，150 V 25min電泳分離，紫外光下對凝膠進行拍照，底片光密度掃描。

1.6 蛋白質的提取和鑒定

1.6.1 總蛋白的提取：取培養12 h的細胞，1500 r／min離心5 min，加入細胞裂解液（8 mol／L尿素，40 g／L CHAPS，2 mmol／L TBP，2 m l／L Bio?Lyte），吹打均勻，4℃振搖30 min，收集細胞裂解液于EP管中，4℃2000 r／min離心1 h，取上清液用Bradford法行蛋白定量。

1.6.2 蛋白免疫印跡法（western?blot）檢測A1蛋白的表達：PVDF膜與鼠抗人A1單克隆抗體（1∶1000）室溫育膜60min；PBST緩沖液洗膜10min×3次；HRP標記抗鼠二抗（1∶5000）育膜60 min，洗膜。將PVDF膜置于化學反應液中5 min進行顯色，取出，洗凈膜，將其放置熒光化學發光圖像分析儀中進行曝光，采用Quantity?one分析系統檢測蛋白條帶的平均密度值，分析目的蛋白相對表達量。

1.7 統計學處理 所有結果均取自1次代表性實驗，結果被3次獨立實驗所證實。所測計量資料用均數±標準差（s）表示，以SPSS 13.0統計軟件進行處理，2組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 前列腺增生組、前列腺癌組和正常組血液中PSA水平比較 正常組PSA水平在正常范圍內，平均濃度為（1.09±0.17）μg／L；前列腺增生組PSA平均濃度為（8.75±0.32）μg／L，45%患者PSA水平集中在4～10 μg／L范圍內；前列腺癌組PSA平均濃度為（14.68± 1.02）μg／L，55%患者PSA水平集中在10～20μg／L。與正常組比較，前列腺增生組和前列腺癌組PSA水平顯著增高（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 不同PAS濃度范圍內各組所占人數對比（n＝20）

2.2 A1 mRNA的表達 在正常組、前列腺增生組和前列腺癌組中，A1 mRNA均表達，PSA濃度在4～10 μg／L時，A1mRNA在前列腺增生組和前列腺癌組的表達差異有統計學意義（P＜0.05）；PSA濃度在10～20 μg／L時，A1 mRNA在前列腺癌組中的表達明顯高于正常組、前列腺增生組和PSA為4～10μg／L的前列腺癌組，差異具有顯著性（P＜0.01）（圖1）。

2.3 A1蛋白的表達 A1蛋白的表達與PCR顯示的結果相一致，當PSA濃度在10～20μg／L時，A1蛋白表達的強弱與PSA的濃度呈正相關（圖2）。

圖1 RT?PCR檢測A1 mRNA

圖2 Westem?blot檢測A1蛋白的表達

3 討論

3.1 PSA在前列腺疾病中的意義 PSA是由前列腺上皮細胞分泌產生的一種絲氨酸蛋白酶，直接分泌到前列腺導管系統內，它的正常功能是幫助精液凝塊水解液化，與男性生育功能有關［1］。正常的前列腺導管系統周圍存在血?上皮屏障，避免前列腺上皮產生的PSA直接進入血液之中，從而維持了血液中PSA的低濃度。一般認為，血清PSA濃度＜4 ng／m l為正常，＞10 ng／m l則患前腺癌的危險性增加。當前列腺發生癌變時可破壞血?上皮屏障，同時癌細胞分泌的PSA增多，致使更多的PSA直接進入血液內［2］。目前臨床用于前列腺癌診斷最廣泛的分子標志物是PSA，在臨床上已將其作為前列腺癌一個重要的篩查指標［3］。大多數前列腺癌病人血清PSA水平超過正常值，PSA提高了低分級、小病灶的早期發現與診斷。但它并不是一個特異性的腫瘤標記物，當其濃度在4～10μg／L時存在一定假陰性、假陽性的病例［4?5］。

3.2 A1在腫瘤中的作用 Bcl?2是細胞凋亡過程中的一類調節因子，此基因家族包含兩類功能相反的基因，一類是抑制細胞凋亡的基因Bcl?2、Bcl?XL、Bcl?w、Bfl?1、Brag?1、Mcl?1和A1等，另一類是促進細胞凋亡的基因Bax、Bak、Bok、Bcl?Xs、Bad、Bid、Bik、Blk和Hrk等。A1基因是造血細胞在粒?巨噬細胞集落刺激因子和脂多糖誘導下產生的早期反應基因，與Bcl?2同源，均為抗凋亡基因，其編碼產物為20kD蛋白質，在羧基C端與Bcl?2蛋白有40%的同源性。A1蛋白主要定位于線粒體外膜，通過C末端疏水性氨基酸直接影響線粒體膜功能，阻止細胞凋亡［6］。

3.3 本研究的意義 本實驗發現A1蛋白的表達與前列腺癌細胞的增殖水平和PSA的濃度密切相關。隨著PSA濃度的增高，A1蛋白表達增高，抑制凋亡能力上升。特別當PSA濃度在4～10μg／L時，難以鑒別診斷前列腺癌和前列腺增生時，將A1和PSA聯合檢測對前列腺癌進行早期診斷，可明顯提高對前列腺癌診斷的準確性，提高了前列腺癌診斷的靈敏度和特異性，減少病人不必要的活檢，為前列腺癌疾病診斷、治療預后觀察提供臨床價值。

［1］ 華立新，喬迪，宋寧宏，等.應用前列腺特異抗原篩查診斷前列腺癌的臨床意義［J］.中華腫瘤雜志，2009，31（9）：705?709.

［2］ Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer JClin，2005，55（2）：74?108.

［3］ 趙旭宏，田野，靳勝，等.前列腺增生的尿液蛋白質組學分析［J］.首都醫科大學學報，2009，30（3）：277?281.

［4］ Wolff JM，Borchers H，Effert PJ，et al.Free?to?total prostate specific antigen serum concentrations in patients with prostate cancer and benign prostatic hyperplasia［J］.Br J Um l，1996，78（3）：409?413.

［5］ 邱梁，邱雁，李江.血清前列腺特異抗原相關參數在前列腺偶發癌的臨床意義［J］.實用老年醫學，2013，27（8）：660?663.

［6］ Maianski NA，Geissler J，Srinivasula SM，etal.Functional char?acterization of mitochondria in neutrophils：a role restricted to apoptosis［J］.Cell Death Differ，2004，11（2）：143?153.

The clinical value of combined detection of A1 protein and prostate specific antigen in prostate cancer and prostatic hyperplasia

MA Zeng?huang．Huangshi Center for Clinical Laboratory，Huangshi435000，China

ObjectiveThis study aims to investigate the clinical value of combined detection of PSA and A1 to dif?ferentiate prostate cancer from bengin prostatic hyperplasia.M ethodsThe serum PSA levels were detected by electro chemiluminescence，The expression of A1 in the prostate cancer and benign prostatic hyperplasia was detected by RT?PCR and western?blotting.The relationship of expression of A1 protein with PSA was analyzed.ResultsThe expression of A1 protein in patients with prostate cancer was significantly lower than that in patients with benign prostatic hyperplasia and healthy persons（P＜0.01）.The expression of A1 protein was related with the concentration of PSA.ConclusionsA1 protein is correlated with themodulation of proliferation in the development of prostate cancer.The expression of A1 protein plays an important role in the development of prostate cancer.The combined detection of PSA and A1 protein is helpful in the diagnosis of prostate cancer.

prostate cancer；prostatic hyperplasia；prestate specific antigen；A1 protein

R 697.3

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.01.014

2013?05?27）

435000湖北省黃石市，黃石市臨床檢驗中心