促血小板生成素對大鼠腦缺血再灌注腦組織的保護作用

鄒成林 陳維鈞 孫曉順 方璟 涂軍 趙亞洲

促血小板生成素對大鼠腦缺血再灌注腦組織的保護作用

鄒成林 陳維鈞 孫曉順 方璟 涂軍 趙亞洲

目的探討促血小板生成素對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后的保護作用及機制。 方法 采用線栓法阻斷大鼠大腦中動脈血流制成局灶性腦缺血再灌注損傷模型。將60只雄性SD大鼠隨機分成促血小板生成素（TPO）組、缺血再灌注組、假手術組和正常組。于缺血開始時TPO組給予TPO 5μg／kg腹腔注射；缺血再灌注組給予等劑量生理鹽水。分別于再灌注6、12、24、48 h后斷頭取腦、切片，進行HE染色、Bcl?2免疫組化染色和細胞凋亡檢測。結果缺血再灌注后，TPO組和缺血再灌注組大鼠缺血側皮層可檢測到凋亡細胞，且TPO組凋亡細胞數明顯少于缺血再灌注組，差異有統計學意義（P＜0.05），而假手術組及正常組未檢測到凋亡細胞；TPO組和缺血再灌注組缺血側皮層Bcl?2陽性細胞數均高于假手術組及正常組，與缺血再灌注組相比，TPO組Bcl?2蛋白表達顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論TPO可抑制缺血再灌注損傷后缺血側皮層的細胞凋亡，其機制可能是通過上調Bcl?2基因表達而實現。

促血小板生成素；缺血再灌注損傷；細胞凋亡；Bcl?2

腦缺血再灌注損傷是急性腦血管病病理生理改變的一個重要方面，有效減輕腦缺血再灌注損傷具有重要的臨床意義。促血小板生成素（TPO）是調節血小板和巨核細胞系最主要的造血生長因子［1］。近年研究發現，TPO不僅參與造血的調控，對神經系統也具有保護作用，它們通過動員骨髓的內源性干細胞，或通過其抗凋亡作用，參與損傷神經組織的修復，在不同種類的神經損傷中發揮神經營養和保護功能。楊默等［2］于2005年首次證實神經系統中存在TPO受體（C?mpl），能促經神經細胞生長，對抗細胞凋亡。本實驗觀察TPO對大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血側皮層Bcl?2的表達及細胞凋亡的影響，探討TPO發揮神經保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，體質量250～290 g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供。10%水合氯醛、SABC試劑盒、DAB顯色劑（武漢博士德）；原位末端標記技術（TUNEL）檢測試劑盒（北京中杉公司），抗Bcl?2抗體、尼龍線直徑2.3 mm（日本伊東公司），Olympus實體顯微鏡、計算機圖像分析軟件，重組人血小板生成素注射液（沈陽三生制藥股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組：將大鼠隨機分為正常組（6只）、假手術組（6只）、缺血再灌注組（24只）、TPO組（24只），觀察點為再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h。采用Longa等［3］的大腦中動脈線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。TPO組于再灌注開始時經腹腔注射TPO 5μg／kg，缺血再灌注組注人等量生理鹽水，正常組及假手術組大鼠不進行缺血再灌注處理。

1.2.2 免疫組化染色檢測Bcl?2蛋白表達：各組大鼠斷頭處死取腦組織，常規固定、石蠟包埋、切片，進行SABC法免疫組化染色。胞漿有棕褐色顆粒者為陽性細胞。每張切片在缺血區隨機計數5個高倍鏡視野（×400）中的陽性細胞數，取平均值為Bcl?2陽性細胞數。

1.2.3 細胞凋亡檢測：按照原位TUNEL試劑盒說明書操作。結果判定：細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，計數凋亡細胞數。每張切片在缺血區隨機計數5個高倍鏡視野（×400）中的陽性細胞數，取平均值為凋亡細胞數。

1.3 統計學處理 采用SPSS 15.0軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差（s）表示，計量資料比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色 缺血再灌注組缺血2 h再灌注24 h后，大鼠缺血側大腦半球明顯腫脹，TPO組缺血側大腦半球腫脹較輕。腦組織切片HE染色顯示：正常組及假手術組皮層無壞死細胞，神經元數量多；缺血再灌注組皮層缺血中心神經元數量稀疏，并可見大量變性及壞死的神經細胞；TPO組神經細胞變性壞死數量少，病變輕。

2.2 原位細胞凋亡檢測結果 缺血再灌注組缺血側可見較多的陽性細胞，假手術組偶見個別陽性細胞，正常組未見陽性細胞。TPO組缺血區陽性細胞數目減少，與缺血再灌注組相比有顯著性差異（P＜0.05）。見表1。

表1 缺血再灌注組和TPO組凋亡細胞數比較（s，個／視野）

表1 缺血再灌注組和TPO組凋亡細胞數比較（s，個／視野）

注：與缺血再灌注組比較，?P＜0.05

組別樣本數（個）凋亡細胞數TPO組24 45.30±7.67?缺血再灌注組24 67.50±9.37

2.3 Bcl?2免疫組化染色結果 缺血再灌注組大鼠缺血周邊區可見較多陽性細胞表達，與正常組相比，有顯著性差異（P＜0.05）。缺血再灌注組及TPO組大鼠再灌注6h時Bcl?2表達增加，24 h達峰值，之后表達出現下降；與缺血再灌注組比較，TPO組各時間點Bcl?2陽性細胞均明顯增加，且差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 大鼠腦缺血再灌注損傷后各時間點Bcl?2陽性細胞數的比較（s，個／視野）

表2 大鼠腦缺血再灌注損傷后各時間點Bcl?2陽性細胞數的比較（s，個／視野）

注：與缺血再灌注組比較，?P＜0.05；與正常組比較，△P＜0.05

組別6 h 12 h 24 h 48 h TPO組50.25±6.59?△60.36±8.79?△78.70±9.79?△68.36±9.20?△缺血再灌注組35.68±5.89△42.25±6.68△55.40±9.39△50.40±8.39△假手術組12.40±2.85 13.40±3.83 14.40±4.75 13.40±3.76正常組11.40±1.93 12.40±3.85 13.40±5.55 12.40±2.26

3 討論

缺血再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程，包括缺血后損傷過程和再灌注后的損傷過程。腦缺血后神經元死亡是一個極其復雜的病理過程。本實驗中原位細胞凋亡檢測結果顯示缺血再灌注組及TPO組缺血側可見較多的陽性細胞，表明細胞凋亡參與缺血再灌注損傷過程。近年來許多學者從形態學、分子生物學等方面研究證實，細胞凋亡參與腦缺血再灌注損傷。

TPO是一種造血正調控因子，可刺激巨核細胞增殖分化、成熟和血小板生成，TPO在腦缺血后腦保護中的作用機制目前尚不十分清楚。有研究認為，TPO對神經細胞有促進生長和抗凋亡的作用［4］。本實驗發現，TPO組缺血腦組織HE染色神經細胞變性壞死數量少，病變輕，同時缺血再灌注組缺血側可見較多的陽性細胞，TPO組缺血區陽性細胞數目減少，與缺血再灌注組相比有顯著性差異（P＜0.05）。說明TPO能保護缺血神經元。TPO是調節巨核細胞增殖、分化、成熟和介導血小板生成的造血因子，它的生物學效應由其受體C?Mpl介導，通過調節干細胞中AKT和STAT等蛋白的磷酸化，從而調節細胞增殖及凋亡［5］。同時有研究發現，TPO可以通過C?mpl受體介導激活內皮細胞合成血小板激活因子并通過STAT信號通路誘導血管生成［6］。Perlingeiro等［7］在最近的研究中首次在成血管細胞中檢測到C?mpl的表達，TPO可支持成血管集落形成細胞的生長，促進成血管細胞增殖，實驗同時證實TPO能明顯減少缺血再灌注損傷誘發的細胞凋亡。

本研究表明，缺血再灌注組Bcl?2陽性細胞表達在各時間點與假手術組相比差別有統計學意義，TPO組在各時間點與缺血再灌注組相比差別有統計學意義。Bcl?2是抑制凋亡的重要基因，本實驗發現TPO組Bcl?2蛋白表達增加，細胞凋亡數減少，提示TPO能減少大鼠腦缺血側大腦細胞凋亡，其減少細胞凋亡的機制可能通過上調Bcl?2表達來實現。Hong等［8］研究表明，腦缺血后上調Bcl?2表達的治療，可縮小梗死面積。其動物實驗表明，缺血8 h之內Bcl?2表達不明顯，之后隨著時間的延長，Bcl?2表達增高，24 h達到高峰，這與本實驗研究結果一致。Plesnila等［9］研究證明，Bcl?2家族與腦缺血時神經元和星形膠質細胞的死亡有緊密關系，應用干預因素可上調Bcl?2的表達，減小梗死面積。李虹等［10］研究也發現，缺血預處理使缺血腦組織Bcl?2蛋白表達增強，抑制凋亡細胞產生。

綜上所述，給予TPO，可使大鼠腦缺血再灌注損傷區神經細胞凋亡數量減少，其保護作用可能是通過上調Bcl?2減少細胞凋亡來實現的。但是由于腦缺血再灌注后神經細胞損傷受到多種基因的調控，TPO還可能通過調控其他基因及其信號轉導通路發揮保護作用，這還待進一步研究。

［1］ Geddis AE，Linden HM，Kaushansky K.Thrombopoietin：a pan?hematopoietic cytokine［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2002，13（1）：61?73.

［2］ 楊默，夏文杰，李桂霞，等.中樞神經系統表達TPO受體的初步研究［J］.中國實驗血液學雜志，2004，12（4）：494?497.

［3］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversiblemiddle cerebral artery occlusion without crainiectomy in rat［J］. Stroke，1989，20（1）：84?91.

［4］ DeLong WG Jr，Born CT.Cytokines in patients with polytrauma［J］.Clin Orthop Relat Res，2004，（422）：57?65.

［5］ Majka M，Janowska?Wieczorek A，Ratajczak J，etal.Stromal?derived factor l and thrombopoietin regulated distinct aspects of human megakarylpoiesis［J］.Blood，2000，96（13）：4142?4151.

［6］ Brizzi MF，Battaqlia E，Montrucchio G，et al.Thrombopoietin stimulates endothelial cellmotility and neoangiogenesis by a platelet?activating factor?dependent mechanism［J］.Circ Res，1999，84（7）：785?796.

［7］ Perlingeiro RC，Kyba M，Bodie S，etal.A role for thrombo?poietin in hemangioblast development［J］.Stem Cells，2003，21（3）：272?280.

［8］ Hong KW，Kim KY，Lee JH，et al.Neuroprotective effect of（2S，3S，4R）?N″?cyano?N?（6?amino?3，4?dihydro?3?hydroxy?2?methyl?2?dimethoxymethyl?2H?benzopyran?4?yl）?N′?benzylgua?nidine（KR?31378），a benzopyran analog，against focal ischemic brain damage in rats［J］.JPharmacol Exp Ther，2002，301（1）：210?216.

［9］ Plesnila N，Zinkel S，Amin?Hanjani S，et al.Function of BID?amolecule of the bcl?2 family?in ischemic cell death in the brain［J］.Eur Surg Res，2002，34（1／2）：37?41.

［10］李虹，鄭世營，張正春，等.預處理對老年鼠腦缺血bcl?2表達及細胞凋亡的影響［J］.實用老年醫學，2005，19（5）：251?252.

Protective effects of thrombopoietin on cerebral ischem ia?reperfusion in rats

ZOU Cheng?lin，CHENWei?jun，SUN Xiao?shun，FANG Jing，TU Jun，ZHAO Ya?zhou．Department of Internal Medicine，the Second People's Hospital of Jingzhou，Jingzhou 434000，China

ObjectiveTo study the protective effects and themechanism of thrombopoietin（TPO）on cerebral is?chemia?reperfusion in rats.M ethodsThread embolism was performed to establish cerebral ischemia?reperfusionmodel in rats.Sixty SD ratswere divided into TPO group，ischemia?reperfusion group，sham?operation group and normal group ran?dom ly.The TPO was given to TPO group at the beginning of ischemia at a dose of 5μg／kg；Ischemia?reperfusion group was given isodose physiological saline.6 h，12 h，24 h and 48 h after reperfusion，the ratswere executed and the brain tis?sues were cut into sections for HE staining and theimmunohistochemical staining to detect Bcl?2 and apoptosis.ResultsAfter ischemia?reperfusion，the apoptotic cellswere detected in TPO group and ischemia?reperfusion group in lateral cortex of rats，and the apoptosis cell number of TPO group was obviously less than thatof ischemia?reperfusion group（P＜0.05）. While no apoptotic cells were detected in sham?operation group and normal group.The number of Bcl?2 positive cells in TPO group and ischemia?reperfusion group was higher than that in control group and normal group.Expression of Bcl?2 pro?tein in TPO group was significantly higher than that in ischemia?reperfusion group（P＜0.05）.ConclusionsTPO can inhibit cell apoptosis of ischemia lateral cortex after ischemia?reperfusion injury，and themechanism may be through raising the expression of Bcl?2 genes.

thrombopoietin；ischemia?reperfusion injury；apoptosis；Bcl?2

R 973

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.01.013

2013?06?25）

434000湖北省荊州市，荊州市第二人民醫院內一科