胃癌患者血清miR-300的表達及臨床意義

龍香娥，董琢，楊杰，吳巧萍，陳慧玲

胃癌患者血清miR-300的表達及臨床意義

龍香娥，董琢，楊杰，吳巧萍，陳慧玲

目的探討胃癌患者血清中miR-300的表達水平及miR-300作為胃癌診斷標記物的可能性。方法采用實時定量RT-PCR方法檢測25例胃癌患者及15例健康志愿者血清中miR-300的表達水平；采用全自動化學發(fā)光免疫分析法，檢測上述標本的血清癌胚抗原（CEA）、癌抗原125（CA125）、癌抗原199（CA199）及癌抗原153（CA153）水平。結(jié)果25例胃癌患者miR-300表達水平是正常人的23.4倍，兩者差異有統(tǒng)計學意義(=0.024)；胃癌患者血清CEA、CA125、CA199及CA153水平顯著高于對照組（均＜0.05）；在胃癌的診斷中miR-300的敏感性比CEA、CA125、CA199及CA153高，但特異性較低。結(jié)論血清miR-300在胃癌中的表達水平高于正常人，對于胃癌的診斷具有一定價值。

胃腫瘤；癌；腫瘤標志物；miR-300

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，病死率高居首位。胃癌的早期診斷、早期治療對于提高胃癌的治療效果、降低病死率十分有效，尋求積極有效的早期診斷胃癌的方法尤為重要。目前臨床上應(yīng)用較多的診斷胃癌的腫瘤標志物存在著敏感度和特異度較低的缺點。本研究的主要目的是通過應(yīng)用實時定量RTPCR檢測胃癌患者血清與正常人群血清中miR-300的表達水平，分析miR-300在胃癌患者血清中的表達水平與正常人的差異，比較miR-300與臨床常用診斷胃癌的腫瘤標志物在胃癌的診斷中的敏感性與特異性，為miR-300作為胃癌輔助診斷的分子標志物提供實驗依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2011年11月至2012年7月寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院胃癌確診住院患者25例，其中男17例，女8例；年齡41～84歲，平均（66.3±10.9）歲。收集15例健康志愿者作為正常對照組，其中男10例，女5例；年齡53～77歲，平均（64.4±8.0）歲。兩組性別和年齡差異均無統(tǒng)計學意義（均＞0.05）。

1.2方法

1.2.1 主要試劑及儀器RNA提取試劑為美國Ambion產(chǎn)品TrizolLSreagent；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒為TAKARA公司產(chǎn)品；U6及miR-300特異RT及PCR引物購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。實時定量PCR儀為美國Stratagene的MX3005P PCR自動系列化分析儀。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 血清總RNA提取及含量測定收集各實驗對象的外周血5 ml，離心分離得所有血清標本放于－20℃冰箱凍存待用。按照抽提RNA試劑Trizol LSreagent的說明書抽提各樣本血清總RNA。抽提的RNA溶解于10lDEPC水中。使用分光光度計測定提取的RNA樣品在260 nm和280 nm的吸收值用以分析RNA的純度。OD260/OD280在1.8～2.0時RNA純度較高。按1OD=40gRNA的公式計算提取的RNA含量。

1.2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及實時熒光定量PCR檢測miRNA-300的水平用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，用熒光定量PCR技術(shù)檢測miRNA-300的表達水平。以U6小RNA作參照，每一樣品設(shè)3個復孔，均分別擴增miRNA和U6小RNA，用Mx3005P QPCR System進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束由計算機自動計算得到各反應(yīng)管Ct值。然后根據(jù)公式計算Ct、Ct的值，計算公式為：Ct=Ct miRNA－Ct U6；Ct=Ct實驗組－Ct對照組。最后以2－△△Ct表示實驗組miR-300的表達水平相對于對照組的差異倍數(shù)。參照相關(guān)文獻，當一個標本的2－Ct值＞2.00時，被認為陽性[1]。

1.2.2.3 其他腫瘤標志物檢測血清癌胚抗原（CEA）、癌抗原125（CA125）、癌抗原199（CA199）、癌抗原153（CA153）均采用化學發(fā)光法檢測，儀器及試劑盒為Beckman公司產(chǎn)品。腫瘤標志物陽性界定值為：CEA＞5ng/ml、CA125＞35 U/ml，CA199＞37 U/ml，CA153＞38 U/ml。

1.3 統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，樣本均數(shù)比較采用獨立樣本檢驗，實驗至少重復3次。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清miR-300的表達水平檢測結(jié)果胃癌患者血清中miR-300的表達水平較正常對照組高，25例胃癌患者血清miR-300表達水平是正常人的23.4倍，按文獻報道的2－Ct值＞2.00為陽性結(jié)果的標準，胃癌患者血清miR-300的陽性率為96%；參照文獻報道的倍數(shù)＞4，認為相對表達差異顯著[2]，25例患者中有21例明顯高于正常組，占整體研究患者的84%。正常對照組Ct平均為（－1.63±0.68），實驗組Ct平均為（－5.18±2.03）；兩組差異有統(tǒng)計學意義（=8.03，＜0.01）。見表1和封三彩圖3。

2.2 血清CEA、CA125、CA199、CA153檢測結(jié)果研究結(jié)果顯示25例胃癌組血清CEA、CA125、CA19-9、CA153平均水平比15例正常組高，且兩者差異有統(tǒng)計學意義（=2.72、2.35、2.36、3.19，均＜0.05）。見表2。

表1 胃癌患者血清中miR-300的表達水平

2.3 血清miR-300及血清腫瘤標志物檢測胃癌的特異性及敏感性25例胃癌患者中，miR-300檢測結(jié)

果為陽性的有24例，而血清腫瘤標志物CEA、CA125、CA199、CA153的檢測中陽性例數(shù)分別為8例、10例、11例、16例，可見血清miR-300在胃癌的診斷中敏感度較其他4種常用血清腫瘤標準物高。15例正常組中，miR-300檢測結(jié)果為陽性的有2例，血清腫瘤標志物CEA、CA125、CA199、CA153的檢測中陽性例數(shù)分別為1例、1例、0例、1例，血清miR-300在胃癌的診斷中特異性較其他血清腫瘤標志物低。見表3。

3 討論

miRNA是一類分子大小為20～25個核苷酸的具有調(diào)控功能的非編碼RNA。近年來研究人員在多種腫瘤（如肺癌、肝細胞癌及宮頸癌等）中發(fā)現(xiàn)了miRNA的異常表達，發(fā)現(xiàn)miRNA與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，miRNA在人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等扮演著重要角色。已有研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及胃癌細胞的凋亡上均有相關(guān)miRNA在發(fā)揮相應(yīng)的作用。在胃癌的發(fā)生發(fā)展中，miR-21、miR-27a等發(fā)揮著促癌作用[3-4]；miR-9、miR-494等發(fā)揮抑癌作用[5-6]。在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中，miR-19、miR-106a等發(fā)揮著促進癌癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用[7-8]；miR-145等發(fā)揮抑制癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用[9]。

miR-300為22個核苷酸的非編碼RNA分子，已有研究結(jié)果顯示miR-300調(diào)控的潛在靶基因在多種生物學進程如細胞凋亡、細胞周期調(diào)控、細胞信號轉(zhuǎn)導等發(fā)揮重要作用[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-300在胃癌患者血清中表達水平明顯增加，25例胃癌患者中miR-300表達水平高于正常人的有24例，即陽性率達96%，21例胃癌患者的miR-300的表達水平明顯高于正常人。

腫瘤標記物是由腫瘤細胞本身合成或者是由機體對腫瘤細胞反應(yīng)而產(chǎn)生的一類物質(zhì)，目前臨床上診斷胃癌的常用的腫瘤標志物有CA199及CEA等。但是目前常用的腫瘤標準物都存在著陽性率和特異性較低的問題[12]。本研究發(fā)現(xiàn)在胃癌的診斷中miR-300有較高的敏感性，而目前臨床上診斷胃癌常用的腫瘤標志物CEA、CA125、CA199及CA153等敏感性均較低；但在胃癌的診斷中miR-300的特異性較低。

本研究將為miR-300作為胃癌輔助診斷的分子標志物提供了可能性。但是本研究還存在著不足，如病例標本數(shù)量不多，非大樣本量的研究，實驗結(jié)果是否存在一定偏差等，需擴大病例標本數(shù)量、結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)進行進一步的研究。

表2 胃癌患者血清腫瘤標志物檢測結(jié)果

表3 血清miR-300及腫瘤標志物檢測胃癌的特異性及敏感性%

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ObjectiveTo investigate the expression level of miR-300 in serum of patients with gastric cancer and to explorethevalueofmiR-300inthediagnosisofgastriccancer.MethodsReal-timequantitativeRT-PCR(qRT-PCR) was performed to detect miR-300 level of 25 gastric cancer patients and 15 healthy volunteers.Automatic chemiluminescence immunoassay was used to detect the serum level of CEA,CA125,CA199 and CA153.ResultsThe expression of miR-300 in 25 gastric cancer patients was 23.4 times as more as the normal controls.Compared with the control group,the levels of CEA,CA125,CA199 and CA153 were higher in patients with gastric cancer.In the diagnosis of gastric cancer,the sensitivity of miR-300 was higher than that of CEA,CA125,CA199 and CA153,but the specificity of miR-300 was lower than that of CEA,CA125,CA199 and CA153.ConclusionsExpression level of serummiR-300ingastriccancerpatientswassignificantlyhigerthanthatinnormalcontrols,andithasdiagnosisvalue in gastric cancer.

Gastric neoplasm;Cancer;Tumor marker;miR-300

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.07.005

R735.2

A

1671-0800(2014)07-0796-04

2011年度寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院校級課題（201103）

315100寧波，寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院（龍香娥、陳慧玲）；浙江醫(yī)藥高等專科學校（董琢）；寧波大學醫(yī)學院（楊杰）；寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院（吳巧萍）

龍香娥，Email：longxiangehappy99@163.com