四神丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)及血清抗炎、促炎因子平衡的影響*

王 燕，朱向東，段永強(qiáng)，李蘭珍，曹燕飛，汪 斌

(甘肅中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論教研室，甘肅 蘭州730000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是以腹瀉、腹痛、黏液膿血便為主要臨床癥狀，以結(jié)腸黏膜慢性炎癥和潰瘍形成為病理特點(diǎn)的一種慢性疑難腸病。該病治愈難度大，且愈后易復(fù)發(fā)［1-2］。由于UC 的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)缺乏特異性治療藥物。四神丸主要由肉豆蔻、補(bǔ)骨脂、吳茱萸、五味子組成，具有溫腎健脾、止瀉固腸的功效。諸多醫(yī)家臨床上常以四神丸加減治療潰瘍性結(jié)腸炎，療效確切，但作用機(jī)制不清。本研究建立UC 大鼠模型，研究四神丸對(duì)實(shí)驗(yàn)性UC 大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)變化及血清中抗炎因子(IL-10)、促炎因子(IL-2、IL-6)平衡的影響，以探討四神丸治療UC 的作用機(jī)制，為該方的臨床廣泛運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF 級(jí)Wistar 大鼠40 只，體質(zhì)量(180 ±10)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)為SYXKC(甘)2004 -0006 -0001561，SPF 級(jí)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為SCXKC(甘)2004 -0006。

1.2 藥品、試劑與儀器

四神丸，由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑室制備。按照原方2∶4∶2∶1∶2 比例取肉豆蔻、補(bǔ)骨脂、五味子、吳茱萸、大棗，用8 倍量700 g/L 的乙醇每次回流2 h，提取3 次，得醇提取液和醇提取藥渣。合并3 次醇提取液，濾過(guò)，濾液減壓回收乙醇后得醇提取濃縮液，干燥得干膏，將干膏粉碎成細(xì)粉，加入揮發(fā)油。實(shí)驗(yàn)用不含賦形劑的浸膏，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ沁拎?SASP)，0.25 g/片，上海三維制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)H32020026。2，4，6 -三硝基苯磺酸(TNBS)，購(gòu)于北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司，由美國(guó)Sigma 公司生產(chǎn)，批號(hào)為2008 -16 -2;蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、考馬斯亮藍(lán)溶液(20090825)，均購(gòu)自南京建成生物工程公司;大鼠IL-2、IL-10、IL-6 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。CT14RD高速冷凍離心機(jī)，天美科技有限公司產(chǎn)品;Bio -Rad iMark 酶標(biāo)儀，美國(guó)BLO-RAD 公司產(chǎn)品;303 -2 型恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器公司產(chǎn)品。

1.3 模型的建立

［1 -3］方法，采用TNBS/乙醇方法建立大鼠UC 模型。將Wistar 大鼠40 只，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水，以100 g/L 水合氯醛腹腔麻醉后，一次性將TNBS/乙醇液(100 μg/g TNBS +500 g/L 的乙醇0.25 mL)用橡膠輸液管輕緩注入大鼠距肛門7 ～8 cm 深的腸腔內(nèi)，捏緊肛門倒置10 min 即可。空白對(duì)照組10 只大鼠采用同樣方法用等量的生理鹽水灌腸。

1.4 動(dòng)物分組與給藥

將動(dòng)物分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、四神丸組及SASP 組4 組，每組10 只。除空白對(duì)照組外均以100 μg/g TNBS 加500 g/L 乙醇0.25 mL 混合試劑灌腸。給藥量按體表面積換算:四神丸組給予四神丸浸膏劑5 g/kg 灌胃，SASP 組按0.3 g/kg 劑量灌胃。灌胃體積均為10 μL/g，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組灌服等體積生理鹽水。各組于造模后第2 天開(kāi)始灌胃，每日1 次，連續(xù)21 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 標(biāo)本的采集

3 周后，脫頸處死大鼠，乙醚麻醉后于股動(dòng)脈采血，室溫靜置10 ～20 min，3 000 r/min 離心10 min，收集上清，備檢。剪取病變最明顯處結(jié)腸組織5 ～8 cm，用冷PBS 緩沖液清洗結(jié)腸，部分結(jié)腸組織以40 g/L 中性多聚甲醛固定，做病理切片，HE 染色，光鏡觀察。

1.5.2 結(jié)腸組織病理形態(tài)及其評(píng)分

參考結(jié)腸病理組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［4］，由兩位富有經(jīng)驗(yàn)的病理教研室老師進(jìn)行雙盲評(píng)分。炎細(xì)胞浸潤(rùn):無(wú)0 分，輕度1 分，重度2 分。浸潤(rùn)深度:黏膜層1 分，黏膜和黏膜下層2 分，結(jié)腸全層3 分。潰瘍深度:無(wú)0 分，上皮1 分，黏膜固有層2 分，黏膜肌層3 分。

1.5.3 IL-10、IL-6、IL-2 含量

采用雙抗體夾心ELISA 法測(cè)定IL-10、IL-6、IL-2含量，嚴(yán)格按試劑盒要求操作。從冰箱取出大鼠血清;取出酶標(biāo)板，依照次序?qū)?yīng)分別加100 μL 的標(biāo)準(zhǔn)品于標(biāo)準(zhǔn)品孔中;分別標(biāo)記樣品編號(hào)，加100 μL樣品于樣品孔中;在對(duì)照品孔和樣品孔中加50 μL的酶標(biāo)記溶液;37 ℃孵育反應(yīng)90 min;手工洗板6 次，每次靜置25 s;將100 μL/well 加入TMB 顯色，37 ℃避光溫育30 min;將100 μL/well 迅速加入終止液終止反應(yīng);10 min 內(nèi)放入酶標(biāo)儀中用雙波長(zhǎng)即檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm 和校正波長(zhǎng)620 nm 同時(shí)讀板，采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)(x-)± 標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況對(duì)比

模型對(duì)照組大鼠在造模當(dāng)天開(kāi)始出現(xiàn)覓食不主動(dòng)，食量減少，稀便，肛周污濁，體質(zhì)量略有下降，毛色晦暗無(wú)光澤，肛門處有糞便沾染，部分大鼠出現(xiàn)血便。四神丸組、SASP 組隨著給藥時(shí)間的持續(xù)，上述表現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，部分大鼠稀便消失，糞便呈灰褐色顆粒狀，毛色逐漸轉(zhuǎn)為光亮潤(rùn)澤，食量正常，活躍，體質(zhì)量略有增加。

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)對(duì)比

模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織有較大潰瘍，潰瘍深度大多至黏膜肌層，有明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，且浸潤(rùn)深至黏膜全層，可見(jiàn)血管擴(kuò)張充血，有糜爛，黏膜上皮層有缺失，固有層腺體明顯減少及破壞，黏膜下層部分可見(jiàn)血管增生。兩個(gè)治療組大鼠的結(jié)腸組織病理形態(tài)有程度不同的改善，其中四神丸組潰瘍基本愈合，腺體增生愈合，有明顯的愈合面存在。見(jiàn)圖1。結(jié)腸病理組織學(xué)評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)(HE，10 ×)

表1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化及血清IL-2、IL-10、IL-6 含量對(duì)比 n=10，μg·L -1±s

表1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化及血清IL-2、IL-10、IL-6 含量對(duì)比 n=10，μg·L -1±s

注:與空白對(duì)照組對(duì)比，* P ＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，# P ＜0.05，## P ＜0.01。

組別 劑量/(g·kg -1) 病理組織學(xué)評(píng)分IL-2 IL-10 IL-6空白對(duì)照組 0 0.75 ±0.64 28.04 ±9.77 53.97 ±11.38 177.25 ±38.65模型對(duì)照組 0 7.10 ±1.19＊＊ 43.05 ±8.42＊＊ 23.47 ±7.66＊＊ 248.05 ±46.56＊＊四神丸組 5 4.17 ±1.40## 28.57 ±2.12## 41.36 ±8.04## 183.50 ±17.74##SASP 組 0.3 3.81 ±0.78## 30.26 ±2.94## 42.36 ±12.51## 193.84 ±44.06#

2.3 各組大鼠血清IL-2、IL-10、IL-6 含量對(duì)比

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠血清IL-2、IL-6 含量增高，IL-10 水平降低，差別有統(tǒng)計(jì)意義(P ＜0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，四神丸、SASP 組的IL-2、IL-6 含量均降低，差別有統(tǒng)計(jì)意義(P ＜0.01或P ＜0.05);IL-10 水平升高，差別有統(tǒng)計(jì)意義(P ＜0.01)。見(jiàn)表1。

3 討 論

UC 發(fā)病率高，危害大。反復(fù)發(fā)作的炎癥性腸病多累及直腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸，是一種病因不明的慢性腸道炎癥，以潰瘍、糜爛為主要臨床表現(xiàn)，作為炎癥性腸病的一種，已被世界衛(wèi)生組織列為消化系統(tǒng)的疑難病［4］。臨床治療目前是以皮質(zhì)類固醇類和氨基水楊酸類等藥物為主，然而這兩類藥物均存在長(zhǎng)期服藥副作用多、停藥后易復(fù)發(fā)、患者耐受性差等問(wèn)題，故從中醫(yī)藥領(lǐng)域探索更為理想的治療藥物已成為近期的研究重點(diǎn)。UC 類似于中醫(yī)學(xué)的“痢疾”“休息痢”“泄瀉”“便血”“腸風(fēng)”等病。有研究通過(guò)規(guī)范專家經(jīng)驗(yàn)辨證，提取證候要素，總結(jié)UC 的常見(jiàn)證候及其證候要素的分布特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)脾腎陽(yáng)虛證是UC 的常見(jiàn)和重要證候［5］。溫腎健脾法是重要的治法，臨床多選治療五更瀉的名方四神丸化裁加減治療，療效顯著，但作用機(jī)制不明。參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子一般分為促炎和抗炎兩類，在UC 發(fā)病機(jī)制研究中，促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子之間的平衡失調(diào)被視為是導(dǎo)致UC 的重要原因。UC 的發(fā)生機(jī)制不僅涉及黏膜局部免疫紊亂，同時(shí)也與全身免疫功能失調(diào)密切相關(guān)。

IL-2 作為重要的促炎細(xì)胞因子，與B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、單核細(xì)胞表面的IL-2 受體結(jié)合后，能引起T 細(xì)胞增殖、活化、增強(qiáng)NK 細(xì)胞活性、促進(jìn)細(xì)胞毒T 細(xì)胞的殺傷作用，因此對(duì)于免疫調(diào)節(jié)有重要意義。有研究表明:［6］IL-2 基因敲除小鼠會(huì)發(fā)生與人類UC 相似的結(jié)腸炎癥。臨床研究［6］顯示:UC患者IL-2 水平降低，表明IL-2 在UC 發(fā)病中起著重要的作用。IL-10 是典型的抗炎與免疫抑制性細(xì)胞因子，它的缺失能導(dǎo)致自發(fā)性的由Th1 T 細(xì)胞介導(dǎo)的類似于CD 的結(jié)腸炎［7］。研究發(fā)現(xiàn):IL-10是具有多重功效的炎癥抑制因子，其主要生物學(xué)活性是免疫抑制作用，能抑制IL-6、TNF-α、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等的產(chǎn)生［8］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):IL-10 基因缺陷小鼠在無(wú)特異性致病菌的普通動(dòng)物飼養(yǎng)條件下能自發(fā)慢性非感染性腸道炎癥［9］，說(shuō)明IL-10 在維持正常腸道黏膜免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用［10］。

IL-6 是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多向性的細(xì)胞因子，可介導(dǎo)免疫球蛋白的分泌，同時(shí)也可提高T 細(xì)胞的活化信號(hào)及促進(jìn)細(xì)胞毒T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞溶解細(xì)胞的能力。有研究［11-12］發(fā)現(xiàn):UC 患者的血清IL-6濃度明顯升高，且與病變范圍和病變嚴(yán)重程度成正相關(guān)。本研究表明:模型對(duì)照組大鼠血清促炎細(xì)胞因子IL-2、IL-6 的含量均明顯高于空白對(duì)照組，而抗炎細(xì)胞因子IL-10 的含量則明顯低于空白對(duì)照組，說(shuō)明抗炎和抑炎細(xì)胞因子的失衡參與了UC 的發(fā)病。經(jīng)過(guò)四神丸治療后，實(shí)驗(yàn)大鼠血清IL-2、IL-6含量均顯著降低，而IL-10 含量顯著升高。此表明:四神丸治療UC 的機(jī)制之一可能是通過(guò)抑制促炎因子IL-2、IL-6 的表達(dá)，提高抗炎因子IL-10 的含量，進(jìn)而調(diào)整了抗炎因子與抑炎因子的平衡，糾正了腸道異常免疫反應(yīng)，從而使腸黏膜組織修復(fù)，炎癥和潰瘍消除。病理組織學(xué)檢查結(jié)果與評(píng)分也與上述結(jié)論一致。

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