DNA指紋技術鑒定尼羅羅非魚各家系父本

黨廣成，季相山，王 慧，劉羽清，付佩勝，劉 洋，趙 燕，宋憬愚

1．山東農業大學，動物科技學院，山東 泰安 271018 2．大連海洋大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116023 3．山東省淡水水產研究所，山東 濟南 250117

親子鑒定(Parentage testing)是現在法醫學上判斷親子關系以及遺傳特征的重要理論和技術，其理論依據是孟德爾的分離定律。按照這一原理，在沒有基因突變和分型錯誤的前提下，子代的同對等位基因必定是一個來自父本，一個來自母本。因此，根據子代和母本的等位基因型可以有效的確認父本的等位基因類型，以多個DNA位點的等位基因累計檢測，達到檢測親子關系的目的。親子鑒定的方法有多種，其中以DNA指紋技術應用較為普遍。自Jefferys[1]博士首先將DNA指紋技術應用于法醫鑒定以來，此方法很快在動物、植物父母本鑒定中得到廣泛發展和應用。尤其是基于微衛星多態性的檢測方法，使得親子鑒定過程更加快速簡單。

微衛星DNA是真核生物基因組重復序列中的主要組成部分，主要由串聯重復單元組成，每單元長度在1～10bp之間，1個SSR的總長度可達幾十到幾百個bp。每個微衛星DNA都由核心序列和側翼序列組成，其核心序列呈串聯重復排列。側翼DNA序列位于核心序列的兩端，為保守的特異單拷貝序列，能使微衛星特異地定位于染色體常染色質區的特定部位[2]。微衛星產生是DNA復制和修復過程中與滑動錯配或染色體減數分裂時姊妹染色單體不均等變換的結果。由于其數量多、在基因組內分布均勻、多態性信息豐富[3，4]、在單個位點基因呈共顯性遺傳、檢測方法快速穩定、所需的DNA量少、易于自動化分析等優點，在DNA指紋技術中有其它遺傳標記無法媲美的優勢。Bowling等[5]利用微衛星位點鑒定出了馬的親本，William等[6]對兩種比目魚進行了親本鑒定。在國內，張志和等[7]應用微衛星分型方法有效的確認了圈養大熊貓的親緣關系，孫業良等[8]用9個微衛星位點從陶賽特羊的嫌疑父本中找出了其父本。

羅非魚起源于非洲，屬熱帶性魚類，棲息于水體的中下層，是以水生植物為主的雜食性魚類。其食性廣，對環境適應性強，抗病性能好，群體產量高，肉味鮮美，國際市場需求量大，是聯合國糧農組織(FAO)推薦的水產養殖中最重要的種類之一，并已成為可替代逐年短缺的鱈魚等海洋優質魚的“白色三文魚”。目前，羅非魚及其雜交種已成為全球重要的魚類養殖品種。全球養殖羅非魚的國家達100多個，我國是世界上主要的羅非魚養殖國之一，年產量在100×104t以上。羅非魚也是我國出口量最大的魚類品種。然而，羅非魚性成熟早、繁殖力強，當年養殖的羅非魚未達到商品規格就能自然繁殖，從而造成養殖池塘中出現二代同“塘”的現象，使得養殖密度過大、養殖個體生長速度減慢、上市規格減小，養殖效益降低；且羅非魚雄性生長速度顯著快于雌性。因此，培育全雄羅非魚苗種，發展羅非魚全雄養殖，將顯著提高羅非魚養殖的經濟效益，促進我國羅非魚養殖業的健康快速發展。黨廣成等[9]研究發現，在羅非魚性腺分化敏感期高溫處理，可誘導其性逆轉，有些家系雄性率甚至達90%以上。高溫誘導正逐漸發展成為一種高雄，甚至全雄羅非魚苗種的培育方法。為了篩選獲得性逆轉高溫敏感家系，人們就需要建立大量的家系，在各家系系譜不是很清楚的情況下，非常有必要利用微衛星標記鑒定各家系的父母本。

羅非魚良種培育始于30年前，由當時設于菲律賓的國際水生生物資源管理中心(ICLARM)選擇以四個非洲品系(埃及、加納、肯尼亞、塞內加爾)和四個亞洲養殖品系(以色列、新加坡、泰國、中國臺灣)的尼羅羅非魚為基礎群，采用家系選育方法進行選育，該國際研究項目為Genetic Improvement of Farmed Tilapia，簡稱GIFT，中文譯稱為養殖羅非魚的基因改良)。此后從該中心引入到其它國家的親本種源均為尼羅羅非魚的改良品系，引入中國時取其項目的縮寫名稱“GIFT”的中譯名“吉富”作為該品系的名稱，由此一直沿用至今。最初吉富品系羅非魚引入中國源于1994年。引進吉富羅非魚后，李思發等又在此基礎上進行選育，成功培育了1個新的羅非魚品種：“新吉富”羅非魚。羅非魚良種培育多數采用家系選育法，需要建立大量的家系，準確掌握其系譜資料，有時也需要借助親子鑒定技術對其親子關系進行鑒定。因此，篩選一些多態性的微衛星標記，建立羅非魚微衛星指紋技術意義重大。

羅非魚具有一種奇特的繁殖習性，雄魚具有非常強的領地性，占領1個領地后，等待雌魚的到來，雌雄魚追尾后，雌魚產卵，雄魚立即排精，雌魚立馬將受精卵吸入口中，受精卵在口腔中孵化，雌魚下頜突起，嘴呈半張開的樣子，通過鰓腔不斷張合、用水流使卵粒在口中不停翻動進行孵育。卵子在口腔中3-7天后即孵出仔魚，此時的仔魚仍不能獨立生活，要待其卵黃囊全部吸收后才被雌魚吐出來。這種特異的繁殖習性為建立家系提供了極大方便，每個雌魚口腔相當于一個小的家系培養容器。

本文目的就是，首先評價6個微衛星標記的多態性，評價微衛星標記數量對累積非父排除率等的影響，評價已知一個雙親或雙親都未知的情況下的累積非父排除率，建立尼羅羅非魚親子鑒定技術，以期為培育羅非魚良種和高雄性率苗種提供一些技術支撐。

1材料和方法

1.1實驗材料

本實驗材料取自山東省淡水水產研究所國家級尼羅羅非魚原良種場，是該場于1998年從無錫淡水漁業研究中心購進的尼羅羅非魚吉富品系繁殖、選育6代后的良種。利用20尾雌魚對8尾雄魚的配對方式構建羅非魚家系，放養于18 m3的水泥池中，每隔5～7 d檢查1次雌魚口腔，若有卵即取出，標記家系號，同時剪取雌魚(即家系母本)的鰭條，保存于酒精中用于提取DNA，繁殖結束后，剪取所有雄魚的鰭條，保存于酒精中用于提取DNA。孵化的仔魚養殖2～4個月后，取鰭條保存于酒精中用于提取DNA。

1.2 DNA的提取

分別選取F33、F34、F35、F36、F37、F52、F53、F55，8個家系的子代個體、各家系母本以及8個候選父本(編號S1―S8)，采用標準的酚-氯仿提取法提取DNA。

1.3 DNA樣品的檢測和稀釋

用722分光光度計測定各DNA樣品的純度和濃度，稀釋至50 ng/μL。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段的大小。

1.4 PCR擴增以及產物檢測

通過查閱文獻，得到6個片段大小在100～300bp之間的微衛星位點：UNH719、UNH846、GM435、GM459、GM558、GM024。設計相關引物(表1)，梯度PCR檢測出最適退火溫度。

PCR采用15 μL反應體系：10×Taq buffer 1.5 μL，MgCl20.9 μL(2 mmol/μL)，dNTP 1.2 μL(1.5 mmol/μL)，上游引物0.5 μL(10 μmol/L)，下游引物0.5 μL(10 μmol/L)，Taq DNA 聚合酶0.2 μL(5 U/μL)，DNA模板1 μL，剩余以水填補。PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性40 s，退火40 s(見表1退火溫度)，72℃延伸40 s，30 個循環；72℃延伸5 min，4℃保存。12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產物，銀染法染色、顯色后拍照。

表1 引物序列信息

1.5數據統計以及處理分析

對電泳結果進行分析，然后利用Cervus3.0分析計算各位點的等位基因數目、等位基因頻率、多態性信息含量、排除率等相關數據。根據各位點的排除率計算累計排除率。計算采用Jamieson等[10]的方法：CPE=1-(1-PE1)(1-PE2)...(1-PEn)。并對各家系進行父權分析，得出置信度。

2結果

2.1各微衛星位點特征分析

利用cervus3.0統計分析各個微衛星位點的特征如表2。各微衛星位點的等位基因數在4～12之間，平均等位基因數為7.17。微衛星位點的觀測雜合度在0.313～0.988之間，平均觀測雜合度為0.696。微衛星位點的期望雜合度在0.318～0.794之間，平均期望雜合度為 0.638。平均多態信息含量為0.608，平均等位基因數為7.17。結果顯示這六個位點具有較高的多態性。其中GM024、GM435、GM459、UNH846四個位點的雜合度和多態信息含量都大于0.5，呈現高度多態性。

表2各微衛星位點特征

2.2排除率分析

各微衛星位點的排除率分析結果見表3，已知一親本時，各個位點的非父排除率由0.301～0.818不等，排除率最高的兩個微衛星標記是UNH719和GM558，排除率最低的微衛星標記是GM024，排除率僅為0.301。雙親未知時，各位點的累計排除率在0.113～0.69之間，排除率最高的微衛星標記是GM558。當已知一親本時，5個位點的累積排除率就達到0.9793，6個位點時，達到0.9962。當雙親都未知時，6個位點的累積排除率也達到了0.9674。因此，利用這6個標記可很好地對各家系的父本進行鑒定。

表3各微衛星位點排除率

2.3父權分析

利用cervus3.0對各家系進行父權模擬分析(Simulation of Paternity Analysis)，根據LOD值確定各家系真正的父本，各家系父本鑒定結果見表4，其中F28，F30和F31的真正父本都是S1；F27和F29的真正父本都是S4；F52，F53和F55的真正父本都是S5，而其他后續父本沒有真正的參與繁殖，這顯示了有些雄魚較為兇猛，獲得了更多的繁殖機會。UNH719在F31家系中的電泳結果見圖1，由圖1可非常容易地看出F31家系的真正父本是S1。

Cervus3.0分析顯示，母本已知時置信度為95%；母本未知時，置信度降至80%。由于尼羅羅非魚各家系母本已知，因此利用這6個標記可較為準確地鑒定各家系父本。

表4尼羅羅非魚親子鑒定結果

圖1 UNH719在F31家系的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

Fig.1PolyacrylamidegelelectrophoresisofUNH719locusinF31family

W：母本; M：marker; S1～S8: 候選父本; F1～F20: 子代

3 討論

羅非魚為一種中小型魚，是世界水產業的重點科研培養的淡水養殖魚類，且被譽為未來動物性蛋白質的主要來源之一。我國于1978年由長江水產研究所首次引進尼羅羅非魚，1994年由上海水產大學引進了尼羅羅非魚吉富品系，1999年無錫淡水漁業研究中心又從埃及引進尼羅羅非魚5000尾，是引進規模最大的一次。除正式的報道外，我國可能實際引種的次數還要多。由于尼羅羅非魚引種次數較多，引種的規模較大，未產生嚴重的遺傳瓶頸。Wang等[11]利用RAPD技術分析顯示，尼羅羅非魚種內相似系數為0.827。本文利用6個微衛星標記分析7個家系個體的遺傳多樣性，結果顯示，各位點的平均觀測雜合度為0.696。但必須認識到羅非魚種質問題的嚴重性，由于羅非魚種類眾多，且很容易種間雜交，并且雜種可育。如果在一個有兩種或兩種以上羅非魚存在的水域引種，就很難保證繁殖的種群仍是純種[12]。

羅非魚具有一種奇特的繁殖習性，雄魚具有非常強的領地性，雌魚口腔含卵孵化，這種特異的繁殖習性為建立家系提供了極大方便，每個雌魚口腔相當于一個小的家系培養容器。利用羅非魚這一奇特的繁殖習性，我們將20尾雌魚和8尾雄魚混養于1個水泥池，成功地建立了8個尼羅羅非魚家系。這8個家系的母本都是已知的，但需要鑒定其父本。

經典的親子鑒定方法首先參照母子的基因型，按孟德爾遺傳定律逐個檢查各個可疑父親的基因型。只要有一個基因座的基因型不合，該可疑父親就被排除。最后所剩的惟一可疑父親就被判定為真父。隨著DNA微衛星標記研究的深入，逐漸將其引入系譜鑒定中來，利用微衛星位點的多態性，以多個微衛星位點在一定群體中各等位基因的頻率為基礎，計算排除概率來進行血緣鑒定和血緣控制。用微衛星 DNA進行親子鑒定具有靈敏、穩定、準確、可靠等優點，因此用微衛星 DNA進行親子鑒定在目前動物遺傳育種研究中具有十分重要的理論和實踐價值。利用微衛星鑒定親子關系日趨廣泛，10個以上的位點鑒定較多[13]，但也不乏10個位點以下的[14]。本文應用DNA指紋技術，在母本已知時，通過六個微衛星位點驗證了用微衛星進行父本鑒定的可行性，有效確認了8個尼羅羅非魚家系的父本。其中母本已知時非父排除率為0.9962，雙親未知時非父排除率為0.9674，分別低于Selvamani等[15]利用鮑魚幼體五個微衛星位點得出的非父排除率0.999和0.995。而Luís等[16]利用六個微衛星位點做馬的親本鑒定時，非父排除率最高達到99.6%。Fridolfsson等[17]利用三個多態性豐富的位點測得非父排除率達96%，與本文研究非父排除率結果相近。由于本實驗母本已知。說明了在多態性豐富的情況下，十個以下的的微衛星位點也可以有效鑒定父本。

本實驗研究得知，微衛星個數、母本是否已知以及置信度水平都會對鑒定產生影響。隨著微衛星個數的增多，鑒定概率會更準確。母本已知也顯然能夠提高排除率。置信度水平雖然受軟件限制，但較排除法等方法更加客觀準確。當然基因分型、無效等位基因以及軟件自身缺陷都可能對親子鑒定造成影響。Inoue等[18]就曾分析指出無效等位基因頻率高于5%的位點不可用于家系分析。至于其他影響因素，有待進一步驗證和探究。

本文利用6個微衛星標記對8個家系的未知父本進行了鑒定，置信度和排除率都達到了較高的水平，表明利用本法可以有效地鑒定尼羅羅非魚各家系的父本。對尼羅羅非魚各家系的父本進行有效的鑒定，有利于尼羅羅非魚(尤其高雄家系)優良遺傳資源的保護，在尼羅羅非魚的養殖推廣和經濟市場化方面有其獨特的意義。

[1]Jefferys AJ, Wilson V, Thein SL. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA [J]. Nature, 1985, 314: 67-73

[2] Botstein D, White RL, skolnick M,etal. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms [J]. Am J Hum Genet, 1980, 32: 3l4-331

[3]趙 燕，季相山，曾勇慶，等.花鱸微衛星標記分離及其多態性分析[J].動物學研究，2011，32：515-520

[4]梁宏偉，李 忠，羅相忠，等.基于微衛星標記的5個尼羅羅非魚品系的遺傳多樣性分析[J].生物多樣性，2009，17(1)：82-87

[5] Bowling AT, Eggleston-Stott ML, Byrns G,etal. Validation of microsatellite markers for routine horse parentage testing [J]. Animal Genetics, 1997, 28: 247-252

[6] William HE, Marc DB, Ira RA,etal. Determination of relative survival of two stocked walleye populations and resident natural-origin fish by microsatellite DNA parentage assignment [J]. Can. J. Fish. Aquat. Sci， 2002, 59: 282-290

[7]張志和，沈富軍，孫 姍，等.應用微衛星分型方法進行大熊貓父親鑒定[J].遺傳，2003，25(5)：504-510

[8]孫業良，國 慶，任航行，等.用微衛星DNA技術進行綿羊親子鑒定[J].安徽農業大學學報，2005，32(3)：301-305

[9]黨廣成，劉羽清，付佩勝，等.高溫誘導對尼羅羅非魚性別分化及生長的影響[J].漁業科學進展，2011，32(5)：32-37

[10] Jamieson A, Taylor SC. Comparisons of three probability formulae for parentage exclusion [J]. Animal Genetics, 1997, 28: 397-400

[11] Wang TQ, Li ZZ, Xia DQ. Analysis of the GenePolymorPhismofO.aureusandO.niloticusby Using RAPD[J]. Developmental and reproductive biology, 1999, 8: 19-24

[12]李學軍，李愛景，彭新亮，等.我國羅非魚的引種及種質資源保護[J].河南水產，2007，1：3-6

[13] Luikart G, Biju-Duval MP, Ertugrul O,etal. Power of 22 microsatellite markers in fluorescent multiplexes for parentage testing in goats (Capra hircus) [J]. Animal Genetics, 1999, 30:431-438

[14] Takenaka O, Kawamoto S, Takawaki H,etal. Polymorphic Microsatellite DNA Amplification Customized or Chimpanzee Paternity Testing [J]. Primates, 1993, 34(1): 27-35

[15] Selvamani MJ, Degnan SM, Degnan BM. Microsatellite genotyping of individual abalone larvae: parentage assignment in aquaculture [J]. Mar. Biotechnol， 2001, 3: 478-485

[16] Lu s C, Cothran EG, Oom MM. Microsatellites in Portuguese autochthonous horse breeds: usefulness for parentage testing [J]. Genetics and Molecular Biology, 2002, 25(2): 131-134

[17] Fridolfsson AK, Gyllensten UB, Jakobsson S. Microsatellite markers for paternity testing in the Willow warbler Phylloscopus tuochihs: high frequency of extra-pair young in an island population [J]. Hereditas, 1997, 126: 127-132

[18] Inoue M, Takenaka O. Japanese macaque microsatellite PCR primers for paternity testing [J]. Primates, 1993, 34(1): 37-45