一株耐鹽弧菌Vibrio sp.K1-L的分離與鑒定

王菲 劉抗 范家同 成守亮 王子元

（江蘇師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，徐州 221116）

一株耐鹽弧菌Vibrio sp.K1-L的分離與鑒定

王菲 劉抗 范家同 成守亮 王子元

（江蘇師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，徐州 221116）

從山西運(yùn)城鹽湖水樣中分離出一株細(xì)菌K1-L，能在2%-10%的MGM固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)群游現(xiàn)象。該菌株為革蘭氏陰性菌，周生鞭毛，電鏡下大小約為0.4 μm×（1-2）μm，其菌落形態(tài)為圓形，灰色。菌株K1-L的最適生長鹽濃度、溫度和pH值的范圍分別為2%-6%、30-40℃和6.0-7.0，GC含量為47.06%。通過對(duì)其形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)，16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)其與Vibrio diabolicus HE800T和Vibrio rotiferianus LMG 21460T等細(xì)菌的16S rRNA有高度同源性，最大的相似性均為99%，確定該菌株K1-L為弧菌屬（Vibrio）。

運(yùn)城鹽湖 弧菌屬 耐鹽菌 系統(tǒng)發(fā)育分析

耐鹽菌對(duì)環(huán)境具有一定的適應(yīng)能力，在一定鹽度范圍內(nèi)微生物通過自身的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制用以平衡細(xì)胞內(nèi)的滲透壓或保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)，進(jìn)而調(diào)節(jié)自身的新陳代謝以適應(yīng)鹽度的變化［1，2］。

近年來，有關(guān)耐鹽及嗜鹽菌用于處理高鹽廢水的研究報(bào)道較多，美國NotreDame大學(xué)的研究人員利用從美國大鹽湖中分離出的菌種處理鹽度為1%-15%的含酚廢水，酚的去除率達(dá)到99%，該試驗(yàn)中分離得到的菌種在含鹽氨氮磷與鐵的環(huán)境中就可生長［3］。耐鹽及嗜鹽菌處理高鹽廢水在廢水處理工藝上得到較多的應(yīng)用。Kargi 等［4］在轉(zhuǎn)動(dòng)式生物轉(zhuǎn)盤中投入嗜鹽菌處理含鹽廢水，含鹽量5%時(shí)的COD去除率為85%。Woolard等［5］利用中度嗜鹽菌處理含鹽量15%的廢水，對(duì)苯酚的去除率高達(dá)99.5%。本研究通過分析從山西運(yùn)城鹽湖水樣中分離的菌株K1-L的16S rRNA基因序列，建立菌株K1-L的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并對(duì)其生理生化特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 菌株K1-L分離自山西運(yùn)城鹽湖水。

1.1.2 試劑 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶等購于Fermentas；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.3 儀器 恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、UV-7504紫

外可見分光光度計(jì)、顯微鏡（Olympus）、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀和日立掃描電鏡。

1.1.4 培養(yǎng)基 5% MGM（Modified growth medium）培養(yǎng)基：30%人工海水166.7 mL/L（配制參照Mike、Dyall-smith所報(bào)道的方法［6］），胰蛋白胨5 g/L，酵母膏1 g/L，去離子水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.5。配制固體培養(yǎng)基時(shí)加1.5%的瓊脂。其它鹽濃度的MGM培養(yǎng)基采用同樣的方法配制。

1.2 方法

其基本原理之二：概念與案例構(gòu)成的多維與非線性的“十字交叉”形狀（“criss-crissing”of conceptual and case landscape）。此原理強(qiáng)調(diào)了真實(shí)情景對(duì)于知識(shí)掌握的重要性，“要多樣化的應(yīng)用知識(shí)，就必須展現(xiàn)知識(shí)的多重聯(lián)系和知識(shí)對(duì)情景脈絡(luò)的依賴性”（李明振等，2007）

1.2.1 菌株的分離方法 從山西運(yùn)城鹽湖取水樣涂布于10% MGM培養(yǎng)基，由于出現(xiàn)向邊緣擴(kuò)散生長的現(xiàn)象（即細(xì)菌群游現(xiàn)象），不能形成單菌落，故將其接種到LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)，能長出單菌落，連續(xù)劃線純化菌株。

1.2.2 形態(tài)學(xué)特征 將菌株K1-L在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，獲得單菌落，觀察其菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色及鞭毛染色［7］，掃描電鏡觀察。

1.2.3 生理生化指標(biāo)的測定

1.2.3.1 生化和酶學(xué)鑒定 參考東秀珠等［8］的著作《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，測定菌株利用糖類、氨基酸的生理特征及MR（Methyl red）和VP（Vogesproskauer）等生化特性，以及接觸酶等酶學(xué)特征。

1.2.3.2 抗生素敏感試驗(yàn)［9］參照美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）紙片擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)分委會(huì)推薦的K-B法（即紙片擴(kuò)散法），以大腸桿菌ATCC 25922作為參照菌株，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

1.2.3.3 鹽濃度對(duì)菌株生長的影響 將菌株K1-L等量的菌懸液分別接種于鹽濃度為0%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、10%、12%、15%、20%的50 mL無菌MGM液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下?lián)u床培養(yǎng)，在培養(yǎng)8 h后測定菌懸液的吸光度OD600值（測量時(shí)調(diào)節(jié)菌液濃度：0.1＜OD600＜0.4），進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。以鹽濃度為橫坐標(biāo)，OD值（測定的OD值乘以稀釋倍數(shù)）為縱坐標(biāo)繪制曲線［10-12］（數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0軟件處理和Excel 2003作圖）。

1.2.3.4 溫度對(duì)菌株生長的影響 將菌株K1-L等量的菌懸液接種于3%MGM液體培養(yǎng)基中，分別于22℃、25℃、30℃、34℃、37℃、40℃條件下培養(yǎng)8 h，測定各溫度下菌株K1-L的OD600值，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。以培養(yǎng)溫度為橫坐標(biāo)，OD值（測定的OD值乘以稀釋倍數(shù)）為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.2.4 菌株16S rRNA基因序列分析 依據(jù)總基因組DNA的提取方法［6］獲得基因組DNA，利用通用引物對(duì)16S rRNA 基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為：27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R（5'-CTA CGG TTA CCT TGT TAC GAC-3'）。PCR反應(yīng)體系：10xPCR緩沖液5 μL，上下游引物各2 μL，dNTPs（5 mmol/L）2 μL，MgCl2（25 mmol/L）5 μL，TaqDNA 聚合酶（5 u/μL）0.5 μL，DNA模板2 μL，加水至50 μL。所用擴(kuò)增程序：95℃，5 min；95℃ 45 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TA克隆，送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。將菌株的16S rRNA基因序列提交到NCBI和EzTaxon server 2.1數(shù)據(jù)庫上，獲得與該菌序列同源性高的相關(guān)菌株16S rRNA基因序列。再用CLUSAL X 1.83軟件［13］進(jìn)行序列比對(duì)。在MEGA version 3.1軟件［14］中用Neighbour-joining法［15］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 篩選結(jié)果

分離出的細(xì)菌命名為K1-L，該菌在2%-10% MGM固體培養(yǎng)基上有群游現(xiàn)象（圖1），菌株在5%MGM培養(yǎng)基上培養(yǎng)11 h群游59 mm。

圖1 菌株K1-L的群游能力

2.2 鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)觀察和生理生化特性 菌株K1-L在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h后形成灰色、圓形、半透明菌落，邊緣整齊，表面光滑。革蘭氏染色為陰性，鞭毛染色可見其鞭毛著生方式為周生（圖2），電鏡下菌株K1-L呈短桿和弧狀，大小為0.4 μm×（1-2）μm（圖3）。生理生化結(jié)果見表1。

表1 菌株K1-L的生理生化特征

圖2 菌株K1-L的鞭毛染色

圖3 菌株K1-L的掃描電鏡照片

2.2.2 16S rRNA序列分析與構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 測序獲得菌株K1-L的16S rRNA 基因序列，獲得大小為1 498 bp的序列，GenBank登錄號(hào)為：JF930162。菌株K1-L的16S rRNA序列與弧菌屬Vibrio diabolicusHE800T和Vibrio rotiferianusLMG 21460T等細(xì)菌的16S rRNA最大相似性均為99%，并與同源性高的相關(guān)菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。

圖4 菌株K1-L的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.3 鹽濃度對(duì)細(xì)菌生長的影響 由圖5可以看出K1-L在1%-15%鹽濃度下均可生長。菌株K1-L的生長最適鹽濃度范圍是2%-6%，可耐受鹽濃度的范圍較廣。

圖5 鹽濃度對(duì)菌株K1-L生長的影響

2.2.4 溫度對(duì)細(xì)菌生長的影響 由圖6可以看出，K1-L在22-40℃的溫度范圍內(nèi)均能生長，最適生長溫度范圍是30-40℃。

圖6 溫度對(duì)菌株K1-L生長的影響

2.2.5 培養(yǎng)基pH值對(duì)細(xì)菌生長的影響 由圖7可以看出，K1-L對(duì)環(huán)境中的pH有較強(qiáng)的耐受能力，尤其耐堿，在pH5.0-10.0的范圍內(nèi)都能生長。K1-L最適生長pH范圍是6.0-7.0。

圖7 培養(yǎng)基pH值對(duì)菌株K1-L生長的影響

3 討論

Drancourt［16］認(rèn)為16S rRNA基因序列相似性≥99%的菌株為同一個(gè)種。通過對(duì)菌株K1-L的16S rRNA基因序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該菌株與弧菌屬（Vibrio）的VibriodiabolicusHE800T、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌等的序列相似性均為99%，確定其為弧菌屬。弧菌屬細(xì)菌分布廣泛，是普通的水生菌，海水和淡水中最為常見，人及動(dòng)物的消化道中也有。從構(gòu)建的進(jìn)化樹上看，菌株K1-L與VibriodiabolicusHE800T和VibrioEx25的聚在一支上，VibriodiabolicusHE800T和VibrioEx25生長在極端環(huán)境中，該地區(qū)有豐富的金屬，而有些金屬正好是這些反應(yīng)所需酶的穩(wěn)定劑或催化劑［17］。而菌株K1-L取自山西運(yùn)城鹽湖，該湖是一個(gè)常溫、常壓和鹽含量高的環(huán)境，可見，它們的生存環(huán)境具有較大差異。

菌種的形態(tài)特征是由遺傳物質(zhì)和生存環(huán)境等因素共同決定的，利用基于形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)等技術(shù)的多相分類鑒定方法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于微生物分類學(xué)研究領(lǐng)域［18］。對(duì)其生理生化指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，K1-L與VibriorotiferianusLMG21460T、VibriodiabolicusHE800T等的氧化酶陽性和對(duì)O/129（150 μg）敏感是它們共有的特性。對(duì)其生長的條件的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，副溶血性弧菌［16］和溶藻弧菌［16，17］、VibriorotiferianusLMG21460T［19］、VibriodiabolicusHE800T鹽濃度生長范圍較窄，而菌株K1-L生長范圍較廣，且在15%的鹽濃度下還能生長，有較高的耐鹽性，原因可能是鹽湖夏季水分蒸發(fā)導(dǎo)致湖水鹽濃度提高，菌株K1-L經(jīng)過長期的進(jìn)化適應(yīng)了這種環(huán)境。

已知VibriodiabolicusHE800T（表2）生長在極端環(huán)境中，該地區(qū)有豐富的金屬，而有些金屬正好是這些反應(yīng)所需酶的穩(wěn)定劑或催化劑。Vibriodiabolicus-HE800T的胞外分泌物表多糖（EPS）具有固著和吸附的作用，這種作用正好可以吸附重金屬使其自身免受傷害［19］。由此可見，可能是由于長期的環(huán)境作用導(dǎo)致VibriodiabolicusHE800T和實(shí)驗(yàn)室所分離K1-L向不同方向的進(jìn)化，且菌株K1-L可在較高鹽濃度下存活，根據(jù)信欣報(bào)道［20］，傳統(tǒng)生物法無法去除含高濃度有機(jī)污染物的廢水，而耐鹽菌可以降解高濃度

有機(jī)廢水，取得了良好的效果。

表2 菌株K1-L與Vibrio diabolicus HE800T［5］特征比較

4 結(jié)論

本研究針對(duì)自山西運(yùn)城鹽湖水中分離得到的細(xì)菌K1-L 進(jìn)行多相分類學(xué)鑒定，并最終確定為弧菌屬，且此菌具有一定的生理生化特征及酶學(xué)活性，且可在較高鹽濃度下存活，在高濃度污水處理方面也有較好的應(yīng)用前景及實(shí)踐意義。

［1］ 李云海, 于德爽, 張培玉. 高鹽度廢水處理中優(yōu)勢耐鹽菌鑒定與生長特性研究［J］.青島理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 30（2）：59-64.

［2］ 周培瑾. 嗜鹽細(xì)菌［J］.微生物學(xué)通報(bào), 1989, 16（1）：31-34.

［3］ Woolard CR, Irvine RL. Treatment of hypersaline wastewater in the sequencing reactor［J］.Water Research, 1995, 29（4）：1159-1168.

［4］ 梁麗娜, 楊合法, 徐智, 等.不同種植模式對(duì)溫室菜地土壤硝態(tài)氮累積的影響［J］.土壤通報(bào), 2010（3）：122-127.

［5］ 張貴龍, 任天志, 李志宏, 等.施氮量對(duì)白蘿卜硝酸鹽含量和土壤硝態(tài)氮淋溶的影響［J］.植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2009, 15（4）877-883.

［6］ Dr.Mike. Dyall-smith. Protocols for haloarcheal genetics. http：// www.haloarchaea.com.Version 7, March 2008.12 .

［7］ Heimbrook ME, Wang WL, Campbell G. Staining bacterial flagella easily［J］. J Clin Microbiol, 1989, 7（11）：2612-2615.

［8］ 東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］. 北京：科學(xué)出版社, 2001.

［9］ Lalitha MK. Manual on antimicrobial susceptibility testing. last print 9/21/2001 .

［10］ Prado B, Lizama C, Aguilera M, et al. Chromohalobacter nigrandesensis sp. nov., amoderately halophilic, Gram-negative bacteriumisolated from Lake Tebenquiche on the Atacama Saltern, Chile［J］. Int J Syst Evol Microbiol, 2006, 56：647-651.

［11］ 沈萍, 范秀容, 李廣武.微生物實(shí)驗(yàn)［M］.第3版. 北京：高等教育出版社, 1996：97-98.

［12］ Widdel F. Theory and measurement of bacterial growth. corrected version：05, 2010 1-7.

［13］ Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, et al. The ClUSTAL X windows interface：Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools［J］. Nucleic Acids Res, 1997, 24：4876-4882.

［14］ Kumar S, Tamura K, Nei M. MEGA3：integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and se brief bioinfor quence alignment［J］. Brief Bioinformtics, 2004, 5：150-163.

［15］ Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method：a new method for reconstructing phylogenetic trees［J］. Mol Biol Evol, 1987, 4：406-425.

［16］ Drancourt M, Bollet C, Carlioz A, et al. 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates［J］. J Clin Microbiol, 2000, 38：3623-3630

［17］ 陶天申, 楊瑞馥, 東秀珠.原核生物系統(tǒng)學(xué)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2007：309-312.

［18］ 劉洋, 趙婷, 姚粟. 一株芝麻香型白酒高溫大曲嗜熱放線菌的分離與鑒定［J］.生物技術(shù)通報(bào), 2012（10）：210-216.

［19］ Guezennec J. Deep-sea hydrothermal vents：A new source of innovative bacterial exopolysaccharides of biotechnological interest［J］. J Ind Microbiol Biotechnol, 2002, 29：204-208.

［20］ 信欣. 耐鹽菌株特性及其在高鹽有機(jī)廢水生物處理中的應(yīng)用［D］. 武漢：中國地質(zhì)大學(xué), 2007.

（責(zé)任編輯 李楠）

Isolation and Identification of a Halotolerant—Vibrio sp. K1-L

Wang Fei Liu Kang Fan Jiatong Cheng Shouliang Wang Ziyuan
（School of Life Science，Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116）

Strain K1-L, isolated from Yuncheng Salt Lake, Shanxi Province, could swim on the 2%-10% MGM medium. The strain K1-L was Gram-negative with polar flagellum and was 0.4 μm ×（1-2）μm under the scanning electron microscope. Strain K1-L appeared grey, rounded colony. Its optimum salt concentration, temperature and pH ranges were 2%-6%, 30-40℃ and 6.0-8.0. The GC content is 47.06%. After comparing the traditional characteristics of morphology, physiological biochemistry and 16S rRNA sequence analysis, we discovered that the strain K1-L was highly homologous to the Vibrio diabolicus HE800Tand Vibrio rotiferianus LMG 21460T. The maximum similarity was 99%. It was asserted that K1-L was belonged to the genus Vibrio, we proposed the name Vibrio sp. K1-L for this strain.

Yuncheng salt lake Vibrio Halotolerant Phylogenetic analysis

2013-10-30

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30571071），江蘇師范大學(xué)王子元教授科研啟動(dòng)基金（KY2009101），江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目，江蘇省教育廳優(yōu)秀創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

王菲，女，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：xzwangfei@126.com

王子元，男，教授，研究方向：極端環(huán)境微生物；E-mail：zwang2229@aliyun.com.cn