以STAT3為靶標的抗腫瘤藥物高通量篩選模型的建立和應用

潘麗 張寧 牛國君 孟晶 劉祥 楊誠

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.南開大學藥學院，天津 300071；3.天津國際生物醫藥聯合研究院，天津 300457；4.南開大學生命科學學院，天津 300071）

以STAT3為靶標的抗腫瘤藥物高通量篩選模型的建立和應用

潘麗 張寧 牛國君 孟晶 劉祥 楊誠

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.南開大學藥學院，天津 300071；3.天津國際生物醫藥聯合研究院，天津 300457；4.南開大學生命科學學院，天津 300071）

旨在建立穩定可靠的以轉導與轉錄激活子（STAT3）為靶標的抗腫瘤高通量篩選模型，應用該模型篩選潛在的抗癌藥物。利用基因重組、蛋白表達純化技術，獲得STAT3目的蛋白，使用酶聯免疫吸附法（ELISA）進行高通量藥物篩選，將篩選出的抑制劑在細胞水平上利用MTT比色法測定化合物對癌細胞增殖的影響。結果顯示，成功構建表達載體pET-28a-STAT3；所建立的模型穩定可行，可用于以STAT3為靶標的抗腫瘤藥物的高通量篩選；用該模型對8 248個樣品進行篩選，在500 μmol/L藥物濃度下，化合物MDC6抑制率為92%，另外，進行IC50值的測定時，分子水平上最低達到3.37 μmol/L，在細胞水平上可達到15.92 μmol/L。建立的高通量藥物篩選模型，具有操作方便、成本低、結果穩定等特點，可用于STAT3抑制劑的大規模篩選。

STAT3 靶點 高通量模型 ELISA

STAT3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3）為STAT家族中的一員，是細胞因子及生長因子受體的信號轉導器和轉錄激活器，其發揮的主要功能是將細胞質內的信號轉導到細胞核內，并與可調節重要生化過程的特異性DNA啟動子序列結合，調控這些基因的表達［1］。

STAT3在機體內多種細胞和組織中都有表達，對正常細胞的生存、增殖、分化、凋亡均具有重要

的調節作用。正常生理狀態下，STAT3的活化快速、短暫且被精確調控，而在多種腫瘤細胞，如肺癌、乳腺癌［2］、惡性黑色素瘤、多發性骨髓瘤、淋巴瘤［3］、前列腺癌、卵巢癌、腦瘤、結腸癌［4］和各種白血病中，均發現由于失去對STAT3的精確調控，導致STAT3在這些腫瘤細胞中得到高表達［5］，并被持續性激活，因而不斷促進與細胞增殖、分化、凋亡、血管生成等有關基因的轉錄［6，7］，最終促進腫瘤的發生和發展。

當細胞因子或生長因子與細胞膜上的受體結合后，JAKs與受體胞漿區域的JAKs結合位點結合后發生酪氨酸磷酸化而活化，JAKs磷酸化受體上的酪氨酸位點，使受體能夠聚集胞漿內的STAT3，STAT3通過SH2區域將STAT補位到受體上的酪氨酸位點，JAKs能使STAT3 705位酪氨酸發生磷酸化，兩個磷酸化的STAT3形成二聚體移至細胞核，可與特定的DNA序列結合，進而調節靶基因的轉錄［8，9］。Haan等［10］依據STAT3 SH2結構域的一段氨基酸序列合成肽段Biotion-bA-PGSAAPpYLKTKFI，采用ELISA方法驗證肽段和STAT3 SH2區域形成二聚體，進而說明兩個磷酸化的STAT3可以通過SH2區域形成二聚體。

隨著分子生物學技術的發展，自動化技術和計算機技術的進步，檢測技術的日趨靈敏，產生了多種分子細胞水平的藥物篩選模型，降低試驗試劑和化合物的用量，減少試驗成本，推進藥物篩選的進程。STAT3近年來成為研究的熱點，本研究根據STAT3形成二聚體的性質，建立以STAT3為靶標的抗腫瘤高通量篩選模型，并應用該模型尋求能夠阻斷STAT3形成二聚體的特異性強、高效、毒副作用小、成本低的抑制劑，用來作為抗癌藥物的先導化合物，并在細胞水平上利用MTT法測定所篩選出化合物對肝癌細胞增殖的影響，最后對化合物進行進一步的優化和驗證，旨在研發新的抗癌類藥物，為癌癥的治療帶來新的希望。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株DH5α，BL21（DE3），原核表達載體pET-28a均為本實驗室保存。PfuDNA聚合酶、限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶購自Fermentas公司；Biospin質粒DNA小量提取試劑盒及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自Bio Flux；F96 MAXISORP—Nunc Immuno Plate（型號442404）、抗His標簽鼠單克隆抗體及HRP標記山羊抗小鼠Ig G抗體購自Thermo Fisher；牛血清蛋白（BSA）和鏈霉親和素購自上海生工生物工程有限公司；二甲基亞砜（DMSO）等化學試劑為市售分析純。肽段底物（Biotion-bAPGSAAPpYLKTKFI）由吉爾生化有限公司合成。?KTA FPLC蛋白純化系統購自GE Healthcare；Multiskan FC 酶標儀購自Thermo fisher scientific。

1.2 方法

1.2.1 質粒構建 由GenBank獲取小鼠STAT3（127AA-722AA）［11，12］序列（BC003806.1），設計上游引物：5'-AAGGATCCGGCCAGGCCAACCAC-3'（酶切位點BamHⅠ），下游引物：5'-CCCTCGAGCTAGTCAATGGTATTGC-3'（酶切位點XhoⅠ）。將STAT3的PCR產物及載體pET-28a都分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，將PCR產物和載體的酶切產物進行回收，再用T4 DNA連接酶進行酶連，轉化到大腸桿菌DH5α中，重組質粒的提取、酶切、PCR以及瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定插入片段的正確性。

1.2.2 蛋白表達、純化和鑒定 將含有目的基因的重組單克隆接種于含100 μg/mL卡那霉素的5 mL LB培養液中，37℃培養過夜。次日將培養好的菌液轉接于800 mL含100 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37℃培養至OD600≈0.6，將培養液溫度降到16℃后加入終濃度為0.4 mmol/L的誘導劑IPTG誘導蛋白表達，培養18 h。4℃ 5 000 r/min離心30 min，棄上清，加25 mL懸菌緩沖液（25 mmol/L Tris，pH8.0，300 mmol/L NaCl，10%甘油）將菌體懸浮，高壓細胞破碎儀破菌后，4℃ 15 000 r/min離心，取上清過Ni2+-NTA瓊脂糖柱，梯度咪唑沖洗蛋白，濃縮蛋白至1 mL后換溶液（20 mmol/L Tris，pH8.0，200 mmol/L NaCl，5%甘油，2 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA）過Superdex 200。將純化得到的蛋白進行蛋白免疫印記雜交試驗。

1.2.3 抑制劑篩選方法 酶聯免疫吸附法：（1）用100 μL的鏈霉親和素包被NUNC 96孔板，16℃過夜。（2）次日棄去板上剩余的鏈霉親和素溶液，用

PBST溶液（1×PBS，pH7.4，0.05% Tween 20）洗3次后，加入200 μL PBST溶解的BSA封閉37℃ 2 h。（3）棄去孔中剩余的封閉液，加入100 μL肽段底物溶液37℃孵育1 h。（4）棄去孔中未結合的底物溶液，用PBST溶液清洗96孔板3次后加入100 μL蛋白溶液，37℃孵育1 h。（5）棄去未結合的蛋白溶液，PBST溶液清洗96孔板3次后加入100 μL用PBST+1%BSA溶液稀釋的一定濃度的抗His標簽鼠單克隆抗體，37℃孵育1 h。（6）棄去未結合的抗His標簽鼠單克隆抗體溶液，用PBST溶液清洗96孔板4-5次，然后加入100 μL用PBST+1%BSA溶液稀釋的一定濃度的HRP標記山羊抗小鼠Ig G抗體，37℃孵育1 h。（7）棄去未結合的HRP標記山羊抗小鼠Ig G抗體溶液，加入100 μL底物緩沖液（0.2 mol/L 醋酸鈉，pH5.0）、500 μL TMB溶液和32 μL 0.75% H2O2的混合溶液37℃孵育15-30 min，然后加入100 μL濃度為2 mol/L的H2SO4終止反應，最后用Multiskan FC 酶標儀檢測450 nm處的吸光值。1.2.4 高通量藥物篩選模型的優化、評價和應用 使用酶聯免疫吸附法摸索優化篩選條件，確定使用BSA、肽段底物、蛋白濃度以及抗His標簽鼠單克隆抗體、HRP標記山羊抗小鼠Ig G抗體的用量，建立穩定的篩選體系。對8 248種藥物進行篩選。針對抑制率80%以上的藥物進行復篩，并測定藥物對蛋白底物相互作用抑制的IC50值。

計算下列模型評價指標：

Z'：統計學指標，Z'≥0.5信噪比大數據重復性較好，比較優秀的藥物篩選體系。AVGmax：最大平均值；AVGmin：最小平均值；SDmax：最大標準差；SDmin：最小標準差；n：孔數。

1.2.5 藥物篩選 初篩樣品8 248個，采用1 μL純度為95%的DMSO作為陰性對照組，不加目的蛋白換為加入相同體積的緩沖液為陽性對照組，使用96孔板進行藥物篩選計算藥物對多肽底物和目的蛋白相互作用的抑制率公式：

抑制率=（陰性對照組-試驗組）/（陰性對照組-陽性對照組）×100%

對抑制率大于80%的樣品進行復篩。復篩時將樣品從2 mmol/L進行梯度稀釋，稀釋10-20個梯度，分別檢測和計算每個濃度的抑制率，以濃度的對數值為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，擬合求得IC50。1.2.6 MTT比色法［13］測定所篩選化合物對肝癌細胞作用 （1）將處于對數生長期的肝癌細胞進行稀釋并分裝到96孔板中，每孔100 μL，96孔板最后一列只加滅過菌的PBS溶液作為對照測量孔。（2）將96孔板放在細胞培養箱（溫度37℃，5% CO2），加入待測藥物，放置在細胞培養箱（37℃，5% CO2）中培養16-48 h，在倒置顯微鏡下進行觀察。（3）呈色：向各孔中加入20 μL的MTT溶液（濃度為0.5%），放回細胞培養箱（37℃，5% CO2）繼續培養，使MTT進入細胞并發生反應，約4 h后終止培養，小心將孔內的培養液吸出棄掉。（4）向每孔中加入150 μL純度為95%的DMSO，振動板5-10 min。（5）使用酶標儀測量490 nm處每個孔溶液的吸光值。

2 結果

2.1 目的基因的克隆以及目的蛋白的表達純化

構建的表達載體經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切電泳結果與預期相符，插入DNA片段與目的基因實際大小（1 788 bp）一致，測序結果表明，STAT3（127-722AA）基因序列和插入載體的方向均正確。重組質粒轉入BL21（DE3）菌株，IPTG誘導目的蛋白大量表達。SDS-PAGE分析和免疫印記分析如圖1所示。

2.2 藥物篩選模型的建立和優化

2.2.1 BSA濃度梯度對篩藥體系的影響 設置不同的鏈霉親和素的濃度梯度及BSA溶液濃度梯度，初步設定底物肽段濃度為5 μg/mL，蛋白濃度為5 μg/mL，抗His標簽鼠單克隆抗體濃度為0.5 μg/mL，HRP標記山羊抗小鼠Ig G抗體濃度為0.5 μg/mL，測量450 nm處吸光值，結果（圖2）顯示，包被上5 μg/mL的鏈霉親和素后，隨著封閉液濃度的增大，數值不斷地減小，BSA濃度為1%時效果最好，所

以選取1% BSA作為封閉液。

圖1 SDS-PAGE分析（A）和免疫印記分析（B）

圖2 鏈霉親和素和BSA濃度梯度的影響

圖3 蛋白濃度和抗His標簽鼠單克隆抗體濃度梯度的影響

圖4 不同的鏈霉親和素濃度和肽段底物濃度的影響

2.2.2 蛋白和抗His標簽鼠單克隆抗體濃度梯度對篩藥體系的影響 選取蛋白濃度梯度、不同抗His標簽鼠單克隆抗體濃度，確定鏈霉親和素濃度為5 μg/mL，肽段底物濃度為5 μg/mL，HRP標記山羊抗小鼠Ig G抗體濃度為0.5 μg/mL，測量450 nm處的吸光值，結果如圖3所示。結合篩選的可行性，確定抗His標簽鼠單克隆抗體濃度為0.25 μg/mL，蛋白濃度為75 μg/mL。

2.2.3 鏈霉親和素和肽段底物的濃度梯度對篩藥體系的影響 確定體系中BSA濃度為1%，蛋白濃度為75 μg/mL，抗His標簽鼠單克隆抗體濃度為0.25 μg/mL，再設置不同鏈霉親和素的濃度梯度，不同肽段底物的濃度梯度，測量450 nm處的吸光值（圖4）。確定最佳的鏈霉親和素濃度為5 μg/mL，肽段底物濃度為5 μg/mL。

綜上可知，最終確定的高通量藥物篩選體系中：鏈霉親和素包被濃度為5 μg/mL，底物肽段濃度為5 μg/mL，封閉液BSA濃度為1%，蛋白濃度為75 μg/mL，抗His標簽鼠單克隆抗體濃度為0.25 μg/mL，HRP標記山羊抗小鼠Ig G抗體濃度為0.5 μg/mL。

2.3 藥物篩選模型的穩定性評價

2.3.1 篩選體系中各組分的影響 在體系中依次不加入鏈霉親和素、抗His標簽鼠單克隆抗體、底物肽段、蛋白，檢測其對吸光值的影響，結果如圖5所示。計算信噪比S/N=8.23＞3，是比較理想的信噪比。

2.3.2 篩選模型評價指標計算 根據篩藥體系中陰性對照組和陽性對照組的數據計算變異系數（CV）和Z'，進而對該模型進行可行性分析，將優化后的體系于96孔板中進行反應，設置陰性對照96孔板（正常反應體系）和陽性對照96孔板，連續3 d，每天進行一次體系驗證。CV陰性對照=2.04%＜20%；CV陽性對照=4.94%＜20%；Z'=0.91＞0.5。各項指標均符合模型篩選的要求。

2.4 藥物篩選結果

對8 248個藥物進行篩選，抑制率在80%以

上的有5種，在500 μmol/L藥物濃度下，化合物MDC6的抑制率最高，為92%，進行IC50值的測定，IC50值最低達到3.37 μmol/L。化合物MDC6 名稱為（1E，6E）-1，7-bis（3，4，5-trimethoxyphenyl）hepta-1，6-diene-3，5-dione，分子式為C25H28O8，結構式如圖6所示，IC50值如圖7所示。

圖5 篩選體系中各組分的影響

圖6 化合物MDC6的結構（C25H28O8）

圖7 化合物MDC6 IC50值的測定

2.5 細胞水平上對化合物 MDC6的測定

利用MTT法在肝癌細胞上進行檢測，結果發現化合物MDC6對肝癌細胞的生長和增殖有較好的抑制作用，IC50值15.92 μmol/L。用Graph Pad Prism 5.0軟件計算MDC6在對肝癌細胞的IC50值如圖8所示。在MDCK細胞（狗腎細胞）中進行CC50測定，終濃度為200 μmol/L 時，其對細胞的致死率仍然小于30%，即CC50＞200 μmol/L，也就是15.92 μmol/L的MDC6對普通細胞無影響。

圖8 細胞水平MDC6的IC50值

3 討論

STAT3參與調節機體的許多生理功能，能夠抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，在人類惡性腫瘤的發生、發展和演進中起到重要作用，其過量表達與腫瘤的發生關系密切。STAT3是近幾年新興的非常有潛力的抗癌靶點，位于JAK-STATs信號通路的最末端，具有較大的優勢，篩選出抑制其活性的化合物就可以抑制整個信號通路，所以建立以STAT3為靶標的高通量篩選模型，并應用該模型篩選STAT3抑制劑對于腫瘤的治療具有重要意義。

藥物篩選是發現新藥的初始階段，目前存在很多種藥物篩選方法，包括電泳遷移位移試驗（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）［14］、酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）［15］和熒光偏振試驗（Fluorescence polarization，FP）［16］。我們使用高通量藥物篩選技術，是基于分子水平和細胞水平的試驗方法進行檢測，能夠大規模地微量快速篩選藥物的新方法。在高通量藥物篩選過程中，方法的選擇和構建是最重要的一個環節。高通量藥物篩選具有速度快、成本低的優點，本研究建立的ELISA高通量STAT3抑制劑藥物篩選模型，具有以下特點：反應體積小，特異性強；操作系統自動化；檢測靈敏快速；結果穩定，在每塊試驗板上均同時設立空白和對照，從而使得結果具有可比性；測定結果可信度高，具有較高的篩選效率，大大提高研發新藥的效率。在試驗中發現部分樣品具有STAT3的激動作用，這在設計試驗時沒有考慮，若將該方法略微改進也可作為STAT3激動劑的篩選模型進行使用。

近年來有關STAT3研究較多，但在大規模藥物篩選中的使用還較少，所以建立穩定可靠的高通量藥物篩選模型具有重要意義。本研究建立的方法雖也存在一定的局限性，如操作步驟較多、需要多次洗板等，但由于本試驗使用的試劑和化合物用量少，尤其是在大規模藥物篩選過程中，能夠有效的降低篩選成本，從而使得該方法具有較高的實用價值。

運用該模型進行藥物篩選，得到化合物MDC6，在分子水平和細胞水平進行IC50值的測定。可在此基礎上對化合物進行進一步的優化和驗證，以研發新的抗癌類藥物，為癌癥的治療帶來新希望。

4 結論

基于酶聯免疫吸附法（ELISA），摸索STAT3蛋白和抗體用量、肽段底物和鏈霉親和素的條件等，確定了體系中各組分的相應濃度，同時對模型穩定性、可靠性進行綜合評價分析，在分子水平上成功建立了STAT3抑制劑的高通量篩選模型。應用該模型對8 248個樣品進行篩選，發現一種化合物MDC6在500 μmol/L藥物濃度下，抑制率為92%，對其進行IC50值的測定時，在分子水平上達到3.37 μmol/L，在細胞水平上達到15.92 μmol/L，對STAT3蛋白有明顯抑制作用。

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（責任編輯 馬鑫）

The Establishment and Application of a High Throughput Screening Model for Inhibitors of STAT3

Pan Li Zhang Ning Niu Guojun Meng Jing Liu Xiang Yang Cheng
（1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. College of Pharmacy，Nankai University，Tianjin 300071；3. Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，Tianjin 300457；4. College of Life Sciences，Nankai University，Tianjin 300071）

It was to establish a viable high-throughput drug screening model for discovering inhibitors of Signal Transducer and Activator of Transcription3, and applied the model to screen potential anti-cancer drugs. The STAT3 gene was amplified with PCR and cloned into the expression vector pET-28a. The recombinant STAT3 was over-expressed and purified, and then was used to bind with specific phosphotyrosine peptides. We established a high-throughput drug screening model based on ELISA to obtain some effective compounds. Further, we tested the effect of them on the growth ability and proliferation of the Hepatoma cells using MTT assay. Results showed that it was not only successfully constructed the expression vector pET-28a-STAT3, but also established a reliable and stable model for drug screening. Besides, 8 248 samples were screened, and a positive sample MDC6 was finally obtained. When the drug concentration was less than 500 μmol/L, the inhibition rate of MDC6 reached 92%. The minimum value of IC50was 3.37 μmol/L, while at the cellular level it was 15.92 μmol/L. In this work, we developed a repeatable and reliable assay for screening of STAT3 inhibitors.

STAT3 Target High-throughput drug screening model ELISA

2014-01-13

國家自然科學基金青年科學基金項目（31200641）

潘麗，女，碩士研究生，研究方向：高通量藥物篩選；E-mail：panlippg@126.com

楊誠，男，博士，教授，研究方向：微生物與生化藥學；E-mail：cheng.yang@htmdc.org