CYP11B2基因第2內含子轉位與醛固酮瘤發病的關系

[摘要] 目的 探討醛固酮瘤CYP11B2基因第2內含子（intron 2）轉位與醛固酮瘤患者發病之間的關系。 方法 應用PCR檢測醛固酮瘤（66例）、醛固酮瘤腫瘤旁腺瘤組織（38例）和正常腎上腺組織（14例）CYP11B2基因intron 2多態性（野生型/轉位型）。 結果 在醛固酮瘤CYP11B2基因intron 2轉位發生率為31.81%，醛固酮瘤腫瘤旁腺瘤組織為20.05%，正常腎上腺組織為14.29%，三者之間無統計學差異。 結論 醛固酮瘤CYP11B2基因intron 2轉位與醛固酮瘤的發生無顯著關聯。

[關鍵詞] CYP11B2；intron 2轉位；醛固酮瘤

[中圖分類號] R736.6 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）05-0129-02

醛固酮瘤是原發醛固酮增多癥中最常見的一種，共同的特點是醛固酮的自主分泌及腎素被抑制。醛固酮的自主分泌是人們研究的熱點，人們已從基因水平上展開研究，CYP11B2基因的改變可能導致醛固酮瘤的發生，CYP11B2基因intron 2常常與CYP11B1基因intron 2發生轉位，本實驗就是研究CYP11B2基因intron 2轉位與醛固酮瘤發病之間的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源

2006年5月～2007年11月在武漢同濟醫院行手術切除并有病理證實為醛固酮瘤患者腺瘤標本66例，醛固酮瘤腫瘤旁腺瘤組織38例和正常腎上腺組織（取自腎癌患者腎上腺）14例，-80℃保存。其中醛固酮瘤患者腺瘤標本女30例，男36例，年齡16～72歲。腫瘤組織全部取自腺瘤中央部分，每個標本組織重約25 mg。

1.2 DNA提取

用DNeasy試劑盒（德國Qiagen公司）按照說明提取DNA，用比色法檢測其濃度，-20℃保存。

1.3 PCR檢測

Intron 2野生型和轉位型基因多態性檢測采用2個獨立的PCR反應。引物均由上海英駿生物技術有限公司合成，野生型基因上游引物5TGGAGAAAAGCCCTACCCTGT-3，下游引物5-AGGAACCTCTGCACGGCC-3；轉位型基因上游引物5-CAGAAAATCCCTCCCCCCTA-3，下游引物5-AGGAACCTCTGCACGGCC-3。PCR反應體系25 μL，按照反應體系：Taq酶master mix 12.5 μL，DNA 1 μg，primer 2 μL加水至25 μL。按反應條件94℃ 30 s，62℃ 15 s，72℃ 22 s，30個循環，72℃延伸5 min擴增目的片段。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠及130 V電壓持續電泳30 min，紫外燈下觀察電泳帶，擴增片段大小約為418 bp。

1.4 統計學方法

采用SPSS12.0統計學軟件包，應用χ2檢驗進行數據處理，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

PCR結果：野生型和轉位型擴增片段大小均為418 bp，在Marker的400～500 bp之間靠近400 bp處可見擴增片段，只有野生型片段者為WW型，只有轉位型片段者為CC型，野生型和轉位型片段均有則為WC型。PCR結果如圖1。

圖1 PCR結果（C為轉位型，W為野生型）

醛固酮瘤患者66例，WW型45例，WC型18例，CC型3例。醛固酮瘤腫瘤旁腺瘤組織38例中WW型30例，WC型8例，CC型0例；正常腎上腺組織（14例）WW型12例，WC型2例，CC型0例。在醛固酮瘤CYP11B2基因intron 2轉位發生率為31.81%，醛固酮瘤腫瘤旁腺瘤組織為20.05%，正常腎上腺組織為14.29%，醛固酮瘤與醛固酮瘤腫瘤旁腺瘤χ2=1.808，醛固酮瘤與正常組織χ2=0.983；醛固酮瘤腫瘤旁腺瘤與正常組織χ2=0.008，P均>0.05。

3 討論

原發性醛固酮增多癥（簡稱原醛）是指由于腎上腺皮質分泌過多的醛固酮而引起潴鈉排鉀，血容量增多而抑制了腎素活性的一種病癥，臨床表現為高血壓和低血鉀綜合征群，腎上腺醛固酮瘤（APA，又稱Conn綜合征）是其最常見一種。醛固酮在球狀帶由醛固酮合成酶催化合成，研究發現醛固酮合成酶基因mRNA在醛固酮瘤中呈現高表達[1]。醛固酮合成酶基因的改變可能引起其mRNA在醛固酮瘤中呈現高表達。11B羥化酶在束狀帶催化合成皮質醇。但是實驗中我們在醛固酮瘤中也發現了CYP11B1基因的表達[1]。說明皮質醇合成酶在醛固酮合成過程中可能有一定的作用，并且CYP11B1和CYP11B2基因常常發生聯系。

有人對醛固酮瘤組織中和外周血中CYP11B2基因進行測序并沒有發現在這些基因編碼區有突變的地方[2]，mRNA是由DNA經hnRNA剪接而成，基因表達時，其外顯子和內含子均轉錄到hnRNA，hnRNA在移出細胞核前將內含子等部分剪除轉變為mRNA。現代研究發現內含子可影響基因的表達，也可以增加mRNA的穩定性。內含子在基因表達中的作用愈來愈受到人們重視。

CYP11B1和CYP11B2基因位于同一基因，相距很近，高度同源，二者的第二位內含子常常發生轉位。CYP11B1基因的二號內含子轉位到CYP11B2基因的第二內含子上，可能會引起CYP11B2基因轉錄發生變化，但是具體還不清楚。不是每個醛固酮瘤患者CYP11B1基因的二號內含子轉位都到CYP11B2基因的第二內含子上，其發生率報道不一，Inglis[3]研究了27例APA中intron 2多態性在原醛和正常人群中的差異，發現intron 2轉位型基因（約70%）明顯高于正常。Jerome等[4]在高血壓患者中研究發現在高ARR值[>145 mol/（L·ng）]患者中intron 2轉位型基因明顯高與低ARR值患者。但是在我們的實驗中并未發現APA患者intron 2轉位型基因高于正常人，它也與腺瘤旁腎上腺組織無明顯差別，這種結果差別也可能與人種或研究數量有關。在正常人群中也發現CYP11B2基因intron 2轉位，說明CYP11B2基因intron 2轉位與CYP11B2基因mRNA高表達并無必然直接聯系。CYP11B2基因intron 2轉位與其啟動子區-344T/C位點存在連鎖不平衡性。Inglis[3]發現APA中CYP11B2基因intron 2轉位與其啟動子區-344T/C位點有顯著連鎖不平衡性（P < 0.01），Jerome等[4]報道在高血壓并高ARR患者中CYP11B2基因intron 2轉位與其啟動子區-344T/C位點有顯著連鎖不平衡性（P < 0.01）。不排除CYP11B2基因intron 2轉位是通過與其有連鎖不平衡性位點即啟動子區-344T/C位點起作用。但是現在關于-344T/C位點報道結果也不一致。我們發現C等位點與醛固酮瘤患者高醛固酮血癥有關[5]。有人則認為T等位點與高醛固酮血癥有關[6]；也有人認為CYP11B2基因啟動區-344T/C等位點C/T沒有顯著性差別[7]。

所以，雖然CYP11B2基因intron 2轉位是CYP11B2基因上常見突變，但是本研究發現其與APA患者血中高醛固酮無顯著關聯。

[參考文獻]

[1] 鄧西元，歐陽金芝，王保軍，等. 11β羥化酶、醛固酮合成酶和類固醇合成因子基因在醛固酮瘤中的表達[J]. 中華實驗外科雜志，2008，25（10）：1350.

[2] Takeda Y，Furukawa K，Inaba S，et al. Genetic analysis of aldosterone synthase in patients with idiopathic hyperald osteronism[J]. Clin Endocrinol Metab，1999，84（5）：1633-1637.

[3] Inglis GC，Plouin PF，Friel EC，et al. Polymorphic differences from normal in the aldosterone synthase gene （CYP11B2） in patients with primary hyperaldosteronism and adrenal tumour （Conns syndrome）[J]. Clin Endocrinol（Oxf），2001，54（6）：725-730.

[4] Jerome N，David B，Lucas A，et al. A biallelic gene polymorphism of CYP11B2 predicts increased aldosterone to rennin ratio in selected hypertensive patients[J]. Clin Endocrinol Metab，2003，86（6）：2495-2500.

[5] 鄧西元，張旭. 醛固酮瘤CYP11B2基因C-344T位點單核苷酸多態性與其發病關系[J]. 現代泌尿外科雜志，2010， 15（5）：336-337，372.

[6] Hautanena A，Lanlinen L，Kupari M，et al. Associations between aldosterone synthase gene polymorphism and the adrenocortical function in males[J]. J Intern Med，1998，244（1）：11-18.

[7] Tsujita Y，Iwai N，Katsuya T，et al. Lack of association between genetic polymorphism of CYP11B2 and hypertension in Japanese： the suita study[J]. Hypertens Res，2001，24（2）：105-109.

（收稿日期：2013-11-18）